Phân tích theo phương pháp của Fatima et al. (2000) có bổ sung. Oxy hoá chuỗi a-xit béo chưa bão hoà bằng cách tách 1 hydrogen trong nhóm alkyl và chèn một nguyên tử oxy dẫn đến việc tạo thành gốc hydroperoxyl hình thành
nên lipid hydroperoxides (LOOHs). LOOHs phân ly tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-hydroxyalkenals (HAE).
Phân tích LOOHs như là một phương pháp xác định phản ứng LPO. Thiobarbituric A-xit Reactive Substance (TBARS) được áp dụng phổ biến nhất. TBARS phản ứng với MDA, sản phẩm được xác định thông qua máy so màu quang phổ ở bước sóng 535nm. Chuẩn bị đường chuẩn với nồng độ MDA tăng dần. Trị số đọc được trên máy so màu quang phổ cho phép tính LPO (nmol MDA/g mẫu). Qui trình thực hiện Chuẩn bị hoá chất:
- Trichloroacetic a-xit 5% (TCA 5%) C2HCl3O2, M: 163,39g/mol 5g TCA/100mL H2O (Trữ lạnh, sử dụng được lâu)
- Dimethyl sulfoxide (DMSO) C2H6OS, M: 78,13
- 2 Thiobarbituric a-xit (TBA) 0,67%, C4H4N2O2S, M:144,15g/mol 67mg TBA + 1mL DMSO trộn đều, sau đó thêm 9 mL nước. Bảo quản tránh ánh sáng (dùng chai nâu hay giấy bạc), sử dụng 1-2 ngày.
- Ethanol M:46,07
- 1,1,3,3-tetramethoxypropan 99%
Malonaldehyde bis (dimethyl acetal) 99%
(CH3O)2CHCH2CH(OCH3)2
TMOP (500µM)
4,167 µL (CH3O)2CHCH2CH(OCH3)2 + 1mL ethanol trộn đều, sau đó thêm 49 mL H2O
Bảng 3.4: Qui trình lập đường chuẩn và phân tích LPO
Chỉ tiêu Nồng độ MDA Thể tích pha loãng Dung dịch chuẩn 500 µM 1 100 µM 1mL dung dịch chuẩn + 4mL nước 2 50 µM 2 mL dung dịch 1 + 2 mL nước 3 10 µM 1 mL dung dịch 2 + 4 mL nước 4 5 µM 2 mL dung dịch 3 + 2 mL nước 5 2,5 µM 2 mL dung dịch 4 + 2 mL nước 6 1,2 µM 2 mL dung dịch 5 + 2 mL nước 7 0,625 µM 2 mL dung dịch 6 + 2 mL nước 8 0 µM Nước ↓
Nồng độ MDA 0 µM 0,625 1,2 µM 2,5 µM 5 µM 1mL µM 1mL 1mL 1mL 1mL 10 µM 1mL 50 µM 1mL 100 µM 1mL ↓
Đặt các ống nghiệm vào nước đá
↓
Thêm vào 1 mL TCA 5%
↓
Thêm vào 1 mL TBA 0,67%
↓
Ủ trong nước sôi 10 phút ===> đọc ở bước sóng 535nm
Phân tích mẫu
0,5 mL mẫu (đã được chuẩn bị trước)
↓
Đặt mẫu vào nước đá
↓
Thêm vào 0,5 mL TCA 5%
↓
Thêm vào 0,5 mL TBA 0,67%
↓
Ly tâm 2200 vòng/phút trong 10 phút ở 40C
↓
Lấy phần nổi cho vào ống thuỷ tinh
↓
Ủ trong nước sôi 10 phút
↓
Để nguội ở nhiệt độ phòng ==> đọc ở bước sóng 535nm
e) Protein
Chỉ tiêu Protein được phân tích để tính toán giá trị các enzyme ChE, CAT và GST.
Nguyên tắc: Lượng Protein được xác định theo phương pháp Lowry et al.
(1951), sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn, Trong môi trường kiềm Cu sẽ tạo phức với protein, Khi Folin được đưa vào, Folin sẽ kết dính với protein. Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh.
Chuẩn bị hoá chất:
- Hỗn hợp A: 150 mL Na2CO3 2% + 1,5 mLCuSO4 1% + 1,5 mL NaK Tartrate 2%.
- Folin: 10mL Folin + 10 mL H2O Bảng 3.5: Qui trình phân tích Protein
Hoá chất ĐVT Đường chuẩn Mẫu
mg protein 0 0,05 0,1 0,2 0,5 BSA μL 0 5 10 20 50 Mẫu μL / / / / / 10 H2O μL 500 495 490 480 450 490 NaOH 1N μL 500 500 500 Ủ 30-120 phút 500 500 500 Hỗn hợp A mL 5 5 5 5 5 5 Ủ 15 phút Folin μL 500 500 500 Ủ 30 phút 500 500 500 Đọc ở bước sóng 660nm
Đường chuẩn Albumin bovine cho phép xác định được lượng protein có trong mẫu (mg protein/mL).
3.6.3.4 Phương pháp phân tích huyết học