Để xác định đặc trưng của cảm biến chúng tôi đưa cảm biến đã được cố định ADN dò vào dung dịch có chứa ADN cần phát hiện. Nếu đoạn ADN cần phát hiện có các ADN phù hợp với các ADN dò, trên bề mặt cảm biến sẽ hình thành một đoạn xoắn kép, khi đó mật độ điện tích ở lân cận bề mặt cảm biến bị thay đổi, làm thay
đổi tín hiệu đầu ra của cảm biến. Khi trong dung dịch không có đoạn ADN phù hợp với ADN dò, tín hiệu đầu ra của cảm biến là không thay đổi. Các kết quả này được mô tả trong hình 3.8.
Hình 3.8. Đặc trưng lai hóa của chuỗi ADN với nồng độ chuỗi ADN dò 10µM, tại nhiệt độ 30oC
Từ hình 3.8 có thể quan sát thấy, tín hiệu của cảm biến tăng tuyến tính với nồng độ ADN cần phát hiện theo hàm y = 0,2765x + 0,2529. Nếu tiếp tục tăng nồng độ ADN đích đến giới hạn bằng nồng độ ADN dò, tín hiệu ra của cảm biến đạt giá trị bão hoà. Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện của cảm biến là 1nM, độ
nhạy của vi cảm biến là 0.276 mV/nM. Khi không có sự bắt cặp giữa đoạn dò và
3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình cố định ADN đến tín hiệu ra của cảm biến.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian cốđịnh DNA.
Thời gian cốđịnh ADN là một trong những yếu tốảnh hưởng đến tín hiệu lai hoá của cảm biến. Bởi vì trong phương pháp cốđịnh này thời gian cốđịnh được gắn liền với quá trình rung siêu âm hỗn hợp ADN và ống nano các bon, nó quyết định
đến sự phân tán của ống nano các bon trong dung dịch ADN và lượng chuỗi ADN dò được hấp phụ lên trên ống nano các bon. Để xét ảnh hưởng của thời gian cốđịnh ADN đến tín hiệu ra của cảm biến, chúng tôi tiến hành khảo sát bốn mẫu thí nghiệm với các thời gian cốđịnh lần lượt là 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian cốđịnh ADN đến tín hiệu ra của cảm biến.
Sau khi được cốđịnh, bốn mẫu thí nghiệm được tiến hành đo lai hoá ở nhiệt
độ phòng. Các đường mô tả ảnh hưởng thời gian cố định đến tín hiệu ra của cảm biến được biểu diễn trong hình 3.9. Quan sát trên hình 3.9 chúng ta có thể thấy, tín hiệu ra của cảm biến tăng khi thời gian cốđịnh tăng. Ở thời gian cốđịnh là 30 phút tín hiệu ra của cảm biến là thấp nhất và gần như không thay đổi. Điều này có thể được giải thích là bởi vì với khoảng thời gian 30 phút, số lượng chuỗi ADN hấp phụ
lên trên ống là ít, khả năng bắt cặp giữa ADN dò và ADN bổ sung không nhiều dẫn
được cố định trên bề mặt ống nano các bon tăng dần, dẫn đến khả năng bắt cặp lai hoá giữa ADN dò và đích cũng tăng lên. Như vậy, có thể nói rằng, sự đáp ứng ra của cảm biến tăng khi thời gian cốđịnh được tăng lên. Trong tất cả các trường hợp, khi nồng độ ADN đích là 7nM, tín hiệu lai hoá đạt giá trị lớn nhất ở 2,3mV, với thời gian cố định là 120 phút. Vì vậy, thời gian 120 phút sẽ được lựa chọn để cố định chuỗi ADN có những thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ ADN dò
Chuỗi ADN dò là một trong những thông số ảnh hưởng lớn đến độ nhạy cũng nhưđộổn định của cảm biến, nó quyết định đến xác suất tương tác giữa ADN dò và ADN đích. Trong công trình này, chúng tôi đã thực hiện việc xác định ảnh hưởng của nồng độ ADN dò đến tín hiệu ra của cảm biến trên bốn mẫu thí nghiệm với các nồng độ ADN dò lần lượt là 1mM, 5mM, 10mM, 20mM, với cùng điều kiện cốđịnh và lai hoá. Đường đặc trưng của các mẫu được mô tả trong hình 3.10. Chuỗi ADN dò được sử dụng trong thí nghiệm này là của vi khuẩn Ecoli có cấu trúc AACGCCGATACCATTACTTA được cung cấp bởi invitrogen. Từ hình 3.10 có thể nhận thấy, tín hiệu ra của cảm biến trong các mẫu 1mM, 5mM, 10mM và 20mM tăng tuyến tính ở nồng độ thấp (0-6nM) và có xu hướng đạt giá trị bão hoà ở dải nồng độ lớn hơn 6nM.
Ở nồng độ ADN dò thấp, đáp ứng tín hiệu ra của cảm biến thấp và ngược lại ở nồng
độ cao, đáp ứng tín hiệu ra là tốt hơn. Điều này đã chứng tỏ rằng, khi cốđịnh một lượng lớn nồng độ ADN dò, mật độ ADN dò được hấp phụ lên ống nano các bon tăng lên dẫn đến lượng ADN dò ở trên bề mặt cảm biến tăng. Khi tiến hành lai hoá với ADN đích, xác suất gặp nhau giữa chuỗi dò và đích tăng làm tăng khả năng hình thành chuỗi xoắn kép trên bề mặt cảm biến, khi đó mật độđiện tích ở lân cận bề mặt cảm biến tăng làm cho tín hiệu đáp ứng của cảm biến tăng.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ CNT.
Tín hiệu ra của cảm biến không chỉ bịảnh hưởng bởi nồng độ chuỗi ADN dò cốđịnh trên bề mặt cảm biến mà còn bịảnh hưởng bởi lượng vật liệu trung gian gắn kết chuỗi ADN với bề mặt cảm biến. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi đã sử
dụng vật liệu trung gian để liên kết chuỗi ADN với bề mặt cảm biến là ống nano các bon. Vì vậy, ảnh hưởng của nồng độ ống nano các bon đến tín hiệu ra của cảm biến sẽđược xem xét nghiên cứu trong phần này. Để khảo sát sựảnh hưởng của nồng độ ống nano các bon đến tín hiệu ra của cảm biến, chúng tối tiến hành khảo sát trên bốn mẫu có điều kiện cố định như nhau, với lượng ống nano các bon lần lượt là 0.3mg, 0.5mg, 0.7mg và 1mg. Đường mô tả ảnh hưởng của hàm lượng ống nano các bon đến tín hiệu ra của cảm biến được biểu diễn trong hình 3.11.
Có thể nhận thấy rằng tín hiệu ra của các mẫu tăng theo nồng độ ống nano các bon. Điều này có thể được giải thích là khi tăng nồng độ ống nano các bon, số
lượng các ống nano được chuỗi ADN dò hấp phụ tăng. Trong quá trình lai hoá, xác suất bắt cặp giữa chuỗi ADN dò và đích tạo thành chuỗi xoắn kép tăng lên, dẫn đến tín hiệu ra của cảm biến tăng. Nhưng với lượng CNT quá nhiều cũng sẽ gây giảm tín hiệu ra của cảm biến do trong quá trình cốđịnh có càng nhiều CNT nó sẽ càng bao phủ lượng ADN trên bề mặt cảm biến, dẫn đến khả năng lai hoá giảm, làm giảm tín hiệu ra của cảm biến
3.2.2.4. Ảnh hưởng của giá trị pH.
Như ta đã biết chuỗi ADN là một phân tử sinh học được cấu tạo bởi các ba zơ, đường và gốc a xit . Nồng độ pH có ảnh hưởng lớn đến các hoạt động của các phân tử này. Vì vậy, tín hiệu ra của cảm biến cũng sẽảnh hưởng bởi độ pH của môi trường cố định. Trong phần này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình cốđịnh tới tín hiệu ra của cảm biến với năm mẫu khảo sát với nồng
độ pH lần lượt là pH 3, pH 5, pH 7, pH 9, pH 11. Tín hiệu ra của cảm biến được thể
hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của giá trị pH đối với tín hiệu ra của cảm biến.
Quan sát tín hiệu trên hình 3.12 có thể thấy rằng, các mẫu có độ pH 3 và pH 11 có tín hiệu ra thay đổi không đáng kể, chứng tỏ khả năng lai hoá giữa chuỗi ADN dò
và chuỗi bổ sung thấp, mẫu có pH 5 và pH 9 tín hiệu ra của cảm biến tốt hơn. Trường hợp pH 7 tín hiệu ra của cảm biến là cao nhất trong các mẫu được khảo sát. Như vậy, ta nhận thấy đối với môi trường cốđịnh có độ axít hoặc ba zơ cao, sự lai hoá giữa các chuỗi ADN dò và chuỗi bổ sung xảy ra không thuận lợi. Sự lai hoá xảy ra thuận lợi hơn trong môi trường trung tính.
Nguyên nhân tạo ra kết quả như trên có thể là do các chuỗi ADN bị thay đổi cấu trúc trong môi trường có độ a xít hoặc ba zơ cao. Do đó, khi tiến hành lai hoá số
lượng chuỗi ADN dò bắt cặp với chuỗi ADN bổ sung thấp nên tín hiệu ra của cảm biến rất nhỏ và không ổn định. Trong môi trường trung tính ADN không bị thay đổi cấu trúc do đó sự bắt cặp diễn ra thuận lợi vì vậy tín hiệu ra của cảm biến lớn hơn.
3.2.3. Độ ổn định của cảm biến
3.2.3.1. Ảnh hưởng của phủ màng BSA.
Độổn định là một trong những thông số quan trọng của cảm biến nói chung và cảm biến ADN nói riêng. Đây có thểđược coi là thước đo đánh giá chất lượng của cảm biến trong việc ứng dụng chúng vào thực tế. Vì vậy, trong phần này, chúng tôi nghiên cứu một phương pháp làm tăng độổn định làm việc của cảm biến bằng cách sau khi cố định ADN lên bề mặt cảm biến, một hợp chất BSA sẽ được phủ lên bề
mặt để tránh sự hấp phụ của các chuỗi ADN đích lên bề mặt cảm biến, dẫn đến tín hiệu lai hoá giả. Để khảo sát ảnh hưởng của màng BSA đến tín hiệu ra của cảm biến, chúng tôi đã khảo sát trên hai mẫu thí nghiệm. Một mẫu sau khi cốđịnh ADN
được phủ một lớp màng BSA, còn một mẫu không được phủ, các số liệu thí nghiệm
được mô tả trong hình 3.13. Từ hình 3.13 có thể nhận thấy, tín hiệu lai hoá trong trường hợp phủ BSA nhỏ hơn so với tín hiệu lai hoá khi bề mặt cảm biến không
được phủ BSA trong quá trình lai hoá. Trong trường hợp này cho thấy, khi sử dụng màng BSA đã ngăn được sự hấp phụ của chuỗi ADN đích lên bề mặt cảm biến, giảm được sự lai hoá giả giữa chuỗi ADN dò và ADN đích.
Hình 3.13. Ảnh hưởng của màng BSA đối với tín hiệu ra của cảm biến.
3.2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lai hoá.
Quá trình bắt cặp của chuỗi ADN dò và chuỗi ADN đích phụ thuộc rất nhiều yếu tố như: nhiệt độ bắt cặp, độ dài chuỗi ADN bổ sung, nồng độ muối trong dung dịch đo. Trong các yếu tố trên thì nhiệt độ là yếu tốảnh hưởng mạnh nhất đến quá trình lai hoá. Để xác định được nhiệt độ lai hoá tối ưu, thì cần thiết phải xác định
được nhiệt độ Tm là nhiệt độ mà ởđó đoạn ADN kép bị tách hoàn toàn thành đoạn ADN đơn. Giá trị nhiệt độ này được gọi là nhiệt độ ‘biến tính’ của ADN. Nó chủ
yếu được xác định bằng số lượng cặp bazơ G − C, và độ dài của đoạn ADN. Do vậy, trong phần này chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lai hoá đến tín hiệu ra của cảm biến ở các nhiệt độ khác nhau lần lượt là 30oC, 45oC, 60oC và 75oC. Tín hiệu ra của cảm biến phụ thuộc vào nhiệt độ lai hoá ở các nồng độ ADN đích khác nhau được thể hiện trên hình 3.14 a. Hình 3.14b mô tả tín hiệu ra của cảm biến phụ thuộc vào nhiệt độ ở nồng độ ADN đích là 9nM. Từ hình 3.14 b có thể nhận thấy rằng, khi tăng dần nhiệt độ 30oC, 45oC, 60oC tín hiệu ra của cảm biến tăng theo, trong khi đó tại nhiệt độ 75oC tín hiệu ra giảm thấp đột ngột. Điều này có thể được giải thích là với các mẫu lai hoá tại 30oC, 45oC, 60oC, các giá trị nhiệt độ này nằm trong khoảng nhiệt độ hồi tính của ADN. Khi đó, nhiệt độ đóng vai trò làm
tăng tốc độ phản ứng, xúc tác cho sự bắt cặp của hai chuỗi ADN đơn thành một chuỗi ADN kép dẫn đến làm tăng tín hiệu ra của cảm biến.
(a) (b)
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ lai hoá tới tín hiệu ra của cảm biến. (a) tại nồng độ chuỗi ADN đích khác nhau, (b) tại nồng độ ADN đích 9nM
Trường hợp mẫu lai hoá lớn hơn 75oC, tín hiệu lai hoá giảm là do nhiệt độ không còn đóng vai trò xúc tác sự bắt cặp của chuỗi ADN mà nó đóng vai trò tách các chuỗi ADN kép thành các chuỗi đơn. Vì vậy, theo lý thuyết, để có giá trị lai hoá tốt nhất nhiệt độ lai hoá thực tế nên nhỏ hơn nhiệt độ Tm khoảng 10% đến 25%.
3.2.3.3. Độ lặp lại của cảm biến.
Thông thường, việc tái sử dụng cảm biến là một trong các đặc điểm mà nhà sản xuất thường hướng tới. Điều này cũng luôn đúng đối với các cảm biến sinh học nói chung và cảm biến ADN nói riêng. Trong phần này, chúng tôi đã nghiên cứu khả năng tái sử dụng vi cảm biến ADN bằng cách tách sợi ADN đích ra khỏi đoạn ADN dò trên bề mặt của vi cảm biến, sau đó sử dụng cảm biến này xác định lai hóa
đoạn ADN.
Quá trình này dựa trên sự biến tính và hồi tính của đoạn xoắn kép ở nhiệt độ
Tm. Để thực hiện biến tính, chúng tôi nâng nhiệt độ lên qua nhiệt độTmđể đảm bảo
đoạn ADN đích và đoạn ADN dò tách nhau hoàn toàn. Sau đó làm nguội nhanh và rửa trôi các đoạn ADN đích ra khỏi bề mặt của vi cảm biến. Thí nghiệm đã được lặp lại để xác định sự phụ thuộc tín hiệu ra của vi cảm biến với nồng độ ADN đích như được mô tả trong hình 3.15.
Hình 3.15. Tín hiệu ra của cảm biến sau hai lần lai hoá.
Kết quả chỉ ra cho thấy, gần như không có sự khác biệt về sự phụ thuộc của tín hiệu lối ra với nồng độ của ADN đích đối với những phép đo trước và sau biến tính.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong quá trình thực hiện đề tài ”Nghiên cứu cố định chuỗi ADN sử dụng ống
nano các bon nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học” chúng tôi đã bước đầu thu
được một số kết qủa khoa học, đóng góp vào việc phát triển các cảm biến ADN để
phát hiện nhanh virut gây bệnh. Những kết quả chính thu được trong khuôn khổ
luận văn này bao gồm:
1. Cố định thành công chuỗi ADN dò của vi khuẩn Ecoli lên bề mặt cảm biến vi độ dẫn thông qua vật liệu trung gian là ống nano các bon bằng phương pháp hấp phụ vật lý. Tác giảđã sử dụng ảnh quang học, ảnh SEM, ảnh TEM, phổ UV-VIS, phổ hồng ngoại, phổ Raman để nghiên cứu quá trình cố định của chuỗi ADN lên bề mặt ống nano các bon. Các thông số cốđịnh đã được tối ưu hoá.
2. Các yếu tố của quá trình cốđịnh ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến đã
được nghiên cứu như: thời gian cốđịnh, nồng độ ADN dò, nồng độ CNT, và pH của dung dịch cố định. Kết quả cho thấy rằng thời gian cốđịnh tối ưu là 120 phút, nồng độ ADN dò 20mM, nồng độ CNT là 1mg, dung dịch cố định có pH7.
3. Ngoài ra độ ổn định và khả năng tái sử dụng cảm biến cũng đã được nghiên cứu. Kết quả khảo sát cho thấy, cảm biến hoạt động ổn định khi có phủ màng BSA. Bên cạnh đó, khảo sát sự lặp lại của cảm biến cho thấy tín hiệu ra của cảm biến trong lần lai hoá thứ hai giảm không nhiều so với lần thứ nhất.
Điều này cho phép có thể tái sử dụng cảm biến trong thực tế.
Kiến nghị:. Để phát triển đề tài chúng tôi dựđịnh sẽ tiếp tục theo một số hướng sau
đây:
1. Nghiên cứu cốđịnh ADN lên bề mặt cảm biến sử dụng phương pháp liên kết cộng hoá trị, điện hoá, để so sánh với phương pháp hấp phụ vật lý.
2. Tiếp tục nghiên cứu triển khai áp dụng phương pháp này cho cảm biến ADN