2.3.3.1. Phương pháp SEM & TEM.
Hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning electron microscopy) là công cụ được sử
dụng rất rộng rãi để quan sát vi cấu trúc ở trên bề mặt của vật chất với độ phóng đại và độ phân giải lớn gấp hàng nghìn lần so với kính hiển vi quang học. Độ phóng đại của SEM nằm trong một dải rộng từ 10 đến 1 triệu lần (của hiển vi quang học từ 1
đến 1000 lần). Độ phân giải của SEM khoảng vài nanomet (10-6mm), trong khi của kính hiển vi quang học là vài micromet (10-3mm), nghĩa là có thể phân biệt được các phân tử lớn như protein hay các phân tử của axit hữu cơ. Ngoài ra SEM còn cho
Điện cực
hoạt động Đ so sánhiện cực
CNT-ADN
độ sâu trường ảnh lớn hơn so với kính hiển vi quang học. Mẫu dùng để quan sát bằng SEM phải được xử lý bề mặt và thao tác của SEM là ở trong chân không.
Cơ sở của phương pháp hiển vi điện tử quét là như sau: Trong hiển vi điện tử
mẫu bị bắn phá bằng chùm tia điện tử có độ hội tụ cao. Nếu mẫu đủ dày thì sau khi tương tác với bề mặt mẫu, các sản phẩm tương tác (các điện tử thứ cấp) sẽ đi theo một hướng khác ra khỏi bề mặt mẫu. Các điện tử thứ cấp này được thu nhận, phân tích và chuyển đổi thành hình ảnh trong SEM. Nếu mẫu đủ mỏng( < 200nm) thì chùm tia tới sẽ xuyên qua mẫu và đây là trường hợp của kỹ thật hiển vi điện tử
xuyên qua TEM. TEM được dùng để thăm dò các khuyết tật trong tinh thể, để khảo sát sự phân bố các pha trong kim loại.
Các loại hiển vi điện tử quét hiện đang được sử dụng rộng rãi. Nhìn trên hình vẽ
cho thấy dải làm việc của các loại hiển vi điện tử quét và hiển vi quang học. Có thể
thấy độ phân giải của các loại hiển vi điện tử quét trùng với kích thước của hầu hết các nguyên tử (từ 0,2nm đến 10µm). Mặt khác trong vùng hiển vi điện tử và hiển vi quang học đều có thể làm việc được thì hình ảnh của SEM có độ sâu, độ rõ nét hơn hẳn hiển vi quang học. Đó là lý do vì sao hay dùng kỹ thuật hiển vi điện tửđể
chụp ảnh hình thái bề mặt hơn hiển vi quang học. Chụp ảnh bề mặt mẫu sẽ cho ta biết được trạng thái bề mặt của mẫu từđó kết luận mẫu được chế tạo tốt hay chưa tốt. Đối với bề mặt lớp mạ, ảnh hiển vi điện tử quét sẽ cho những thông tin về độ
mịn, kích thước hạt, độ che phủ của lớp mạ với nền... 0.1nm 1.0nm 10nm 100nm 1µm 10µm 100µm 1mm Hình 2.4. Dải làm việc của các kỹ thuật hiển vi điện tử và quang học. TEM SEM Hiển vi quang học HREM
Hình 2.5. Sơđồ nguyên lý cấu tạo máy SEM
Nguyên tắc của phương pháp: Chùm điện tử bắn vào bề mặt mẫu electron phản xạ thu được hình ảnh thông qua bộ detectơ.
Một số ứng dụng của SEM: Tùy từng loại tín hiệu thu được mà thông tin tương
ứng sẽ khác nhau. Thông thường dùng SEM có các công dụng chính sau: + Điện tử thứ cấp (SEI): Dùng để quan sát hình thái bề mặt.
+ Điện tử tán xạ ngược ( BEI): dùng để quan sát thành phần và địa hình bề
mặt.
+ Tia X (X-Ray) : Phân tích nguyên tố có trong mẫu.
+ Huỳnh quang catot (CL): Khảo sát các đặc trưng bên trong. + Suất điện động (EBIC):Khảo sát các đặc trưng bên trong.
2.3.3.2. Phổ tử ngoại UV – Vis.
Vùng UV - Vis bao gồm vùng cực tím, vùng tím và dải sóng ngắn thuộc miền nhìn thấy. Đối với mục đích thí nghiệm người ta thường sử dụng bức xạ điện từ trong vùng tử ngoại gần (λ = 190 ÷ 400nm) và vùng nhìn thấy (λ = 400 ÷ 800nm). Sự hấp thụ bức xạ UV – Vis có tính chọn lọc đặc trưng cho các hợp chất chưa no, xác định sự tồn tại của các electron π. Trong phép phân tích phổ UV – Vis, định luật Lambe – Bughe – Beer được sử dụng ở dạng:
ởđây : c – nồng độ chất; [c] = mol.l-1.
D – mật độ quang; ε - hệ số hấp thụ riêng, tương ứng với lớp hấp thụ có chiều dày 1cm.
l – chiều dầy lớp hấp thụ; [l] = cm.
Đường biểu diễn sự phụ thuộc của đường độ hấp thụ vào bước sóng λđược gọi là phổ hấp thụ UV – Vis. Phổ nhận được có thể có một hay vài pic hấp thụ. Mỗi pic đặc trưng cho một trạng thái điện tử bị kích thích trong phân tử hay ứng với một trạng thái trung gian riêng của chất. Bởi vậy:
- Từ phổ hấp thụ ta xác định được λmax của từng dải phổ. Dựa vào λmax xác định năng lượng các bước chuyển electron. Trong một số trường hợp ta có thểđồng nhất chất nghiên cứu với một chất nào đó cho trước.
- Phổ UV – Vis cũng được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu tương tác cho nhận trong quá trình polyme hóa các radical. Phổ UV – Vis còn cho phép nghiên cứu các polyme ở dạng rắn như là màng, bột hay các viên nén nhận được từ hỗn hợp polyme với KBr hay BaSO4.
- Dựa vào quan hệ λmax với các yếu tốảnh hưởng của điều kiện thực nghiệm ta có thể xác định loại bước chuyển ứng với đám phổđó.
- Đối với một chất xác định ta có thể xây dựng quan hệ D – c để phân tích
định lượng. Phổ UV – Vis cũng được sử dụng để nghiên cứu một số quá trình xảy ra trong dung dịch: xác định thành phần dung dịch các phức chất, xác định hằng số
cơ bản của phản ứng, xác định các chất trung gian trong quá trình polyme hóa…
2.3.3.3. Phổ hồng ngoại FTIR .
Phổ hồng ngoại là một trong các phương pháp quang học dựa trên đặc tính tương tác của chất với bức xạ nhiệt trong vùng hồng ngoại (vùng bước sóng dài với
λ = 0,75 ÷ 1000µm). Trong hóa hữu cơ thường chỉ dùng bức xạ hồng ngoại trong vùng 4000cm-1đến 650cm-1 (λ = 2,5 ÷ 15,3µm). Sự hấp thụ tia bức xạđược miêu tả
theo định luật Lambe – Bughe – Beer: I = I0.10-εct
Với ε - Hệ số hấp thụ riêng, [ε] = 1mol-1.cm-1; c - Nồng độ chất, [c] = mol.l-1; l – chiều dày lớp vật chất, [l] = cm; I0 – cường độ tia sáng đơn sắc đến mẫu; I – Cường
độ tia sáng đơn sắc ra khỏi mẫu; t – thời gian truyền sóng.
Trong thực tế, định luật Lambe – Bughe – Beer được sử dụng ở dạng: Log(I0/I) = ε.c.l = D
D – là mật độ truyền quang qua của chất. Phổ hấp thụ là mối quan hệ giữa độ truyền qua T = [I0/I].100% theo số sóng υ = λ-1. Sự hấp thụ tia đơn sắc liên quan đến các dạng dao động trong phân tử. Tần số dao động của nhóm nguyên tử nào đó trong phân tử không phụ thuộc vào phần còn lại của phân tửđược gọi là tần sốđặc trưng (tần số nhóm) thường được dùng để phát hiện nhóm chức trong phân tử.
Phương pháp phổ hồng ngoại, ngoài tác dụng phân tích định tính, định lượng còn có vai trò hết sức quan trọng trong việc phân tích cấu trúc phân tử. Dựa theo tần số cường độđể xác định sự tồn tại các nhóm liên kết trong phân tử. Sự dịch chuyển của tần sốđặc trưng và thay đổi cường độ phản ánh sự tương tác của các nhóm, các liên kết cạnh nhau trong phân tử.
2.3.3.4. Phổ Raman.
Bên cạnh phương pháp phân tích phổ hồng ngoại , quang phổ Raman cũng được sử dụng để xác định các liên kết của các phân tử, đặc biệt là các phân tử sinh học trong dung dịch nước bởi vì nước là chất tán xạ Raman yếu. Cơ chế phổ Raman
được thể hiện trên hình 2.6.
Hình 2.6. Cơ chế phổ Raman
Trong quang phổ Raman, mẫu được chiếu xạ bởi chùm laser cường độ mạnh trong vùng tử ngoại-khả kiến (v0) và chùm ánh sáng tán xạ thường được quan sát theo phương vuông góc với chùm tia tới. Ánh sáng tán xạ bao gồm hai loại : một
được gọi là tán xạ Rayleigh, rất mạnh và có tần số giống với tần số chùm tia tới (v0); loại còn lại được gọi là tán xạ Raman, rất yếu( 10−5
chùm tia tới) có tần số là 0 m
v ±v , trong đó vmlà tần số dao động phân tử. Vạch v0−vmđược gọi là vạch Stockes và vạch v0+vmgọi là vạch phản Stockes. Do đó, trong quang phổ Raman, chúng ta đo tần số dao động (vm) như là sự dịch chuyển so với tần số chùm tia tới (v0). Khác với phổ hồng ngoại, phổ Raman được đo trong vùng tử ngoại-khả kiến mà ởđó các vạch kích thích (laser) cũng như các vạch Raman cùng xuất hiện.
Theo lý thuyết cổđiển, tán xạ Raman có thểđược giải thích như sau : Cường độ điện trường E của sóng điện từ (chùm laser) dao động theo thời gian có dạng:
0cos 2 0
E E= πv t
Trong đó, E0là biên độ dao động và v0là tần số laser. Nếu một phân tử hai nguyên tửđược chiếu bởi ánh sang này thì một momen lưỡng cực điện sẽ xuất hiện do cảm ứng có dạng sau : P=αE=αE0cos 2πv t0
Trong đó αlà hằng số tỷ lệ được gọi là hệ số phân cực. Nếu phân tử dao động với tần số vm, thì sự dịch chuyển q của hạt nhân có dạng sau :
0cos 2 m
q q= πv t
Trong đó q0 là biên độ dao động. Với biên độ dao động nhỏ, αlà hàm tuyến tính theo q. Do đó, chúng ta có thể viết : 0 0 ... q q α α α= +⎛⎜∂ ⎞⎟ + ∂ ⎝ ⎠ Suy ra : 0 0 0 0 0 0 0 0
cos 2 cos 2 cos 2
P E v t E v t qE v t q α α π α π ⎛∂ ⎞ π = = + ⎜∂ ⎟ ⎝ ⎠ 0 0 0 0 0 0 0
cos 2 cos 2 .cos 2 m
P E v t q E v t v t q α α π ⎛∂ ⎞ π π = + ⎜ ∂ ⎟ ⎝ ⎠ 0 0 0 0 0[ 0 0 ] 0 1
cos 2 cos 2 ( ) cos 2 ( )
2 m m P E v t q E v v t v v t q α α π ⎛∂ ⎞ π π = + ⎜ ⎟ + + − ∂ ⎝ ⎠
Theo lý thuyết cổđiển, số hạng thứ nhất mô tả một lưỡng cực dao động mà nó bức xạ tần số v0(tán xạ Rayleigh); số hạng thứ hai là tương ứng với tán xạ Raman với tần số v0+vm (phản Stockes) và v0−vm(Stockes). Nếu 0 q α ⎛∂ ⎞ ⎜∂ ⎟
⎝ ⎠ bằng không thì sự dao động không thể tạo ra phổ Raman. Nói chung,
để có phổ Raman thì tỷ số này phải khác không.
Trong phổ Raman bình thường, vạch kích thích (v0) được chọn sao cho năng lượng của nó là thấp hơn nhiều so với trạng thái kích thích của điện tử. Đường chấm chấm mô tả trạng thái ảo để phân biệt nó với trạng thái kích thích thực. Như ta biết, mật độ phân tửở trạng thái v=0 là lớn hơn rất nhiều ở trạng thái v=1(định luật phân bố Maxwell-Boltzmann). Do đó, ởđiều kiện thường các vạch Stockes (S) mạnh hơn vạch phản Stockes (A). Do cả hai đều cho thông tin giống nhau, nên người ta chỉđo phần phổ Stockes.
Hình 2.7. So sánh các mức năng lượng của phổ Raman thường, Raman cộng hưởng và huỳnh quang cộng hưởng
Tán xạ Raman cộng hưởng (RR) xảy ra khi vạch kích thích được chọn sao cho mức năng lượng của nó nằm trên vùng kích thích điện tử. Ở trạng thái lỏng và trạng thái rắn, các mức dao động được mở rộng tạo nên một vùng liên tục. Ở trạng thái khí, một vùng liên tục nằm trên một chuỗi các mức gián đoạn. Sự kích thích các vùng liên tục này tạo thành phổ RR làm tăng mạnh dãy Raman bắt nguồn từ sự dịch
chuyển điện tử đặc biệt này. Thuật ngữ “tiền cộng hưởng” được sử dụng khi vạch kích thích (về năng lượng) nằm gần sát với trạng thái kích thích điện tử.
Sự huỳnh quang cộng hưởng (RF) xảy ra khi phân tử được kích thích đến một mức gián đoạn của trạng thái kích thích điện tử. Sự huỳnh quang cộng hưởng được quan sát thấy ở các phân tử khí, chẳng hạn I2, Br2,…
Cuối cùng, phổ huỳnh quang được quan sát thấy khi phân tử ở trạng thái kích thích trở về mức dao động thấp nhất thông qua các dịch chuyển không bức xạ (về
trạng thái trung gian) và sau đó mới phát ra bức xạ (khi dịch chuyển từ trạng thái trung gian này về trạng thái thấp nhất). Thời gian sống ở trạng thái kích thích trong phổ RR là rất ngắn ( 10−14
s) trong khi đó ở phổ RF và phổ huỳnh quang là dài hơn khá nhiều (10−8−10−5s).
2.3.3.5. Xây dựng hệ đo và phương pháp đo xác định sự lai hoá
a. Xây dựng hệđo
Để kiểm tra độ nhạy, thời gian đáp ứng, độđặc hiệu cũng như khả năng phát hiện các đoạn axit nucleic đặc hiệu của ADN của vi rút, chúng tôi sử dụng bộ
khuếch đại Lock-in SR830.
- Bộ khuếch đại Lock-in SR830
Bộ khuếch đại Lock-in SR830 dùng để phát hiện và đo tín hiệu xoay chiều rất nhỏ, với điện áp cỡ vài nano vôn. Phép đo được thực hiện chính xác ngay cả khi tín hiệu nhỏ bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác lớn hơn hàng nghìn lần. Bộ khuếch
đại nhạy pha được dùng để khuếch đại và chọn lọc tín hiệu có ích, giảm nhiễu. Đây là thành phần đơn lẻ trong số các thành phần của tín hiệu tại tần số và pha chuẩn riêng biệt. Tín hiệu nhiễu tại tần số khác với tần số chuẩn đặc trưng được loại bỏ và không ảnh hưởng đến phép đo. Dạng sóng từ bộ khuếch đại lock-in được mô tả trên hình 2.8. Bộ khuếch đại SR830 phát ra sóng hình sin có dạng VLsin(ωLt + θref). Tín hiệu này sau đó được khuếch đại bởi bộ phát hiện độ nhạy pha hoặc bộ nhân. Đầu ra của bộ phát hiện độ nhạy pha này là hai sóng hình sin.
= 1/2 VsigVLcos([ωr - ωL]t + θsig - θref) -1/2 VsigVLcos([ωr + ωL]t + θsig + θref) (2.2) Sig Ref TÝn hiÖu chuÈn TÝn hiÖu h×nh sin TÝn hiÖu tõ Lock-in Hình 2.8. Dạng sóng từ bộ khuếch đại Lock-in
Đó là hai tín hiệu xoay chiều, có tần số tại (ωr - ωL) và (ωr + ωL). Nếu đầu ra của bộ phát hiện độ nhạy pha được cho qua bộ lọc tần thấp, tín hiệu xoay chiều có tần số cao được loại bỏ. Tuy nhiên, nếu ωr bằng ωL thì thành phần hiệu hai tần số sẽ
là tín hiệu một chiều. Trong trường hợp này, đầu ra của hệ phát hiện độ nhạy pha
được đưa qua bộ lọc sẽ là Vpsd = 1/2 VsigVLcos(θsig - θref). Đây là tín hiệu một chiều tỷ lệ với tín hiệu khuếch đại.
b. Phương pháp đo.
Khi có sự lai hoá giữa các chuỗi ADN đích với ADN đầu dò được cố định trên bề mặt vi cảm biến sẽ tạo sự thay đổi mật độ điện tích trên bề mặt cảm biến. Lúc này, vùng điện cực chỉ phủ màng CNT sẽđóng vai trò là điện cực so sánh, còn
điện cực phủ CNT gắn ADN đóng vai trò là điện cực hoạt động sẽ có giá trị chênh lệch về độ dẫn so với điện cực so sánh. Từđó, ta xác định được sự phụ thuộc giữa nồng độ của ADN và sự chênh lệch về độ dẫn giữa hai vùng vi điện cực. Sự chênh lệch độ dẫn giữa hai vùng vi điện cực này được đưa vào máy Lock-in SR830 để xử
- Bố trí hệđo
Quá trình đo này sẽđược mô tả ngắn gọn như sau: Tín hiệu chuẩn của dòng xoay chiều có tần số 10 KHz và biên độ 100 mV được lấy từ bộ khuếch đại Lock-in SR830, đặt vào hai vi điện cực. Tín hiệu ra lúc này được đặt trên hai điện trở 1KΩ
đưa vào hai kênh A và B của bộ khếch đại (hình 2.9).
Hình 2.9. Hệđo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830
- Nguyên lý đo
Từ cách bố trí hệđo như trên, ta có thể vẽđược mạch tương đương của hệđo vi sai như hình 2.10.
Với: S là tín hiệu so sánh từ bộ phát với điện áp V = 100mV. Rout là điện trở ngoài, Rout = 1KΩ.
R là điện trở của màng polyme dẫn.
G là vôn kế (Điện áp ra Voutđược hiển thị).
Vin ~ Vout A B ● R (1K) R (1K) Điện cực so sánh Điện cực hoạt động Mẫu phân tích