a. Xây dựng hệđo
Để kiểm tra độ nhạy, thời gian đáp ứng, độđặc hiệu cũng như khả năng phát hiện các đoạn axit nucleic đặc hiệu của ADN của vi rút, chúng tôi sử dụng bộ
khuếch đại Lock-in SR830.
- Bộ khuếch đại Lock-in SR830
Bộ khuếch đại Lock-in SR830 dùng để phát hiện và đo tín hiệu xoay chiều rất nhỏ, với điện áp cỡ vài nano vôn. Phép đo được thực hiện chính xác ngay cả khi tín hiệu nhỏ bị nhiễu bởi các nguồn nhiễu khác lớn hơn hàng nghìn lần. Bộ khuếch
đại nhạy pha được dùng để khuếch đại và chọn lọc tín hiệu có ích, giảm nhiễu. Đây là thành phần đơn lẻ trong số các thành phần của tín hiệu tại tần số và pha chuẩn riêng biệt. Tín hiệu nhiễu tại tần số khác với tần số chuẩn đặc trưng được loại bỏ và không ảnh hưởng đến phép đo. Dạng sóng từ bộ khuếch đại lock-in được mô tả trên hình 2.8. Bộ khuếch đại SR830 phát ra sóng hình sin có dạng VLsin(ωLt + θref). Tín hiệu này sau đó được khuếch đại bởi bộ phát hiện độ nhạy pha hoặc bộ nhân. Đầu ra của bộ phát hiện độ nhạy pha này là hai sóng hình sin.
= 1/2 VsigVLcos([ωr - ωL]t + θsig - θref) -1/2 VsigVLcos([ωr + ωL]t + θsig + θref) (2.2) Sig Ref TÝn hiÖu chuÈn TÝn hiÖu h×nh sin TÝn hiÖu tõ Lock-in Hình 2.8. Dạng sóng từ bộ khuếch đại Lock-in
Đó là hai tín hiệu xoay chiều, có tần số tại (ωr - ωL) và (ωr + ωL). Nếu đầu ra của bộ phát hiện độ nhạy pha được cho qua bộ lọc tần thấp, tín hiệu xoay chiều có tần số cao được loại bỏ. Tuy nhiên, nếu ωr bằng ωL thì thành phần hiệu hai tần số sẽ
là tín hiệu một chiều. Trong trường hợp này, đầu ra của hệ phát hiện độ nhạy pha
được đưa qua bộ lọc sẽ là Vpsd = 1/2 VsigVLcos(θsig - θref). Đây là tín hiệu một chiều tỷ lệ với tín hiệu khuếch đại.
b. Phương pháp đo.
Khi có sự lai hoá giữa các chuỗi ADN đích với ADN đầu dò được cố định trên bề mặt vi cảm biến sẽ tạo sự thay đổi mật độ điện tích trên bề mặt cảm biến. Lúc này, vùng điện cực chỉ phủ màng CNT sẽđóng vai trò là điện cực so sánh, còn
điện cực phủ CNT gắn ADN đóng vai trò là điện cực hoạt động sẽ có giá trị chênh lệch về độ dẫn so với điện cực so sánh. Từđó, ta xác định được sự phụ thuộc giữa nồng độ của ADN và sự chênh lệch về độ dẫn giữa hai vùng vi điện cực. Sự chênh lệch độ dẫn giữa hai vùng vi điện cực này được đưa vào máy Lock-in SR830 để xử
- Bố trí hệđo
Quá trình đo này sẽđược mô tả ngắn gọn như sau: Tín hiệu chuẩn của dòng xoay chiều có tần số 10 KHz và biên độ 100 mV được lấy từ bộ khuếch đại Lock-in SR830, đặt vào hai vi điện cực. Tín hiệu ra lúc này được đặt trên hai điện trở 1KΩ
đưa vào hai kênh A và B của bộ khếch đại (hình 2.9).
Hình 2.9. Hệđo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830
- Nguyên lý đo
Từ cách bố trí hệđo như trên, ta có thể vẽđược mạch tương đương của hệđo vi sai như hình 2.10.
Với: S là tín hiệu so sánh từ bộ phát với điện áp V = 100mV. Rout là điện trở ngoài, Rout = 1KΩ.
R là điện trở của màng polyme dẫn.
G là vôn kế (Điện áp ra Voutđược hiển thị).
Vin ~ Vout A B ● R (1K) R (1K) Điện cực so sánh Điện cực hoạt động Mẫu phân tích
Hình 2.10. Mạch tương đương của hệđo vi sai
Khi đó dòng điện của hệđo được xác định bởi công thức dưới đây:
out R R V I + = (2.3) Mặt khác: out out R V I = (2.4) Từ (2.3) và (2.4) ta có: out out out R V V V R= + (2.5)
Độ dẫn được tính theo công thức:
G = 1/R (2.6)
Từ (2.5), (2.6) độ dẫn của màng polyme dẫn có dạng: (V Voutout)Rout
V R G + = = 1 (2.7) Do, V >> Vout (V = 100 mV, Vout ~ mV ), khi đó ta có:
out out R V V G . = (2.8) Hay: ( ) 100 10 10 1 3 V S x V G = − out − = out (2.9) Hoặc: ( ) 100 S V G= ∆ out ∆ (2.10) - Thực hiện các phép đo.
Sau khi đã nối vi cảm biến với đầu vào của bộ khuếch đại Lock-in. Các phép đo
được thực hiện như sau :
+ Nhúng vi cảm biến đã cốđịnh ADN đầu dò vào trong một cốc nhỏ chứa 300µl nước khử ion.
+ Mẫu phân tích có nồng độ khác nhau được nhỏ vào trong cốc tuỳ theo phép đo nhằm xác định khả năng bắt cặp của ADN đầu dò và ADN đích trên bề mặt vi cảm biến theo nồng độ. Tín hiệu được thể hiện bằng sự chênh lệch thế đầu ra giữa điện cực so sánh và điện cực hoạt động.
Các phép đo được lặp lại với từng phương pháp cốđịnh nhằm tổng hợp, so sánh và
đưa ra phương pháp cốđịnh tốt nhất. Kết quả phép đo cho phép chúng tôi có những
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cố định ADN lên bề mặt ống nano các bon
3.1.1. Phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN
3.1.1.1. Ảnh quang học ống nano các bon phân tán trong dung dịch ADN, nước.
Phân tán ống nano các bon là bước đầu tiên trong quá trình sử dụng ống nano các bon để ứng dụng cho các loại cảm biến nói chung cũng như cảm biến sinh học nói riêng. Như chúng ta đã biết, ống nano sau khi được chế tạo bằng những phương pháp khác nhau sẽ hình thành dưới các dạng búi hoặc dạng bó. Ở trạng thái này,
ống nano chưa thểđưa vào sử dụng được. Do vậy, để sử dụng ống nano các bon cho những ứng dụng khác nhau, chúng ta cần phân tán (tách) các ống nano các bon ở
dạng bó thành các ống nano ở dạng đơn lẻ. Vì vậy, để xác định sự phân tán của ống nano các bon chúng tôi tiến hành khảo sát trên hai mẫu: ống nano các bon được phân tán trong nước (mẫu a) và được phân tán trong dung dịch ADN (mẫu b), sau
đó chúng tôi so sánh kết quả phân tán của hai mẫu này nhằm tìm ra sự khác biệt giữa ống nano các bon được phân tán trong dung dịch ADN so với ống nano các bon không được phân tán.
Hình 3.1. Ảnh quang học phân tán ống nano các bon sau 2 tháng lưu trữ trong nước (a), trong dung dịch ADN (b). Công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
Quá trình phân tán hai mẫu này được thực hiện ở cùng một chếđộ. Hình 3.1 mô tả ảnh quang học quá trình phân tán ống nano các bon trong nước (a) và trong dung dịch ADN (b) sau 2 tháng được lưu trữ trong điều kiện bình thường, công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
Khi quan sát CNT phân tán trong nước (hình 3.1a) thấy rằng, ống nano các bon sau khi được phân tán đã bị lắng hoàn toàn xuống đáy lọ sau 2 tháng lưu trữ. Trong khi đó, quan sát ở mẫu CNT phân tán trong dung dịch ADN cho thấy, dung dịch có màu đen, không bị lắng như mẫu phân tán trong nước (hình 3.1b). Điều này có thể khẳng định được rằng ở cùng điều kiện phân tán như nhau ống nano các bon rất khó được phân tán trong nước nhưng nó được phân tán rất tốt trong dung dịch ADN. Để phân tích quá trình phân tán ống nano các bon rõ hơn chúng tôi đã sử
dụng phổ UV-vis nhưđược mô tả trong phần tiếp theo.
3.1.1.2. Phổ UV-Vis phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN
Sử dụng phổ UV-vis là phương pháp phổ biến để đặc trưng trạng thái keo của sự
phân tán ống nano các bon dựa vào các đỉnh của phổ hấp thụ [26,39]. Theo Junrong Yu và các cộng sự [24], các ống nano các bon đơn sẽ hoạt động tốt trong miền UV nhưng các búi ống nano các bon lại rất khó hoạt động trong vùng này. Mặt khác, cường độđỉnh hấp phụ tỷ lệ với nồng độống nano các bon được phân tán. Hình 3.2 mô tả phổ UV-vis của ống nano các bon được phân tán trong dung dịch ADN (3.2 a) và mối liên hệ giữa cường độ đỉnh hấp thụ với thời gian phân tán ống nano các bon (3.2 b). Quan sát trong hình 3.2 a đã chỉ ra cho thấy, đỉnh hấp thụ ống nano các bon xuất hiện ở khoảng 260 nm và giảm dần về phía miền IR. Điều này có thể chỉ ra rằng, các bó ống nano các bon đã phân tán tốt trong dung dịch ADN để trở thành các ống nano các bon đơn. Hình 3.2b biểu diễn mối quan hệ giữa cường độđỉnh hấp phụ với thời gian phân tán. Các mẫu trong thí nghiệm này được thực hiện theo thời gian rung siêu âm lần lượt là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút. Tương
ứng với mỗi giá trị thời gian siêu âm khác nhau sẽ xuất hiện các đỉnh hấp phụ có cường độ khác nhau. Khi thời gian siêu âm càng dài thì cường độđỉnh hấp thụ càng tăng hay nói các khác ống nano các bon được phân tán càng tốt. Vì vậy, ở đây chúng tôi đã lựa chọn thời gian siêu âm là 120 phút để phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN.
Hình 3.2. Phổ UV-vis ống nano các bon phân tán trong dung dịch ADN (a), mối quan hệ giữa cường độ đỉnh hấp phụ với thời gian phân tán (b). Công suất siêu âm 125W, 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
3.1.1.3. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN. dịch ADN.
Sau khi phân tán ống nano các bon trong dung dịch ADN, chúng tôi đã sử
dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để xác định một cách định tính sự phân tán của ống nano các bon trong dung dịch ADN.
Hình 3.3. Ảnh TEM của ống nano các bon phân tán trong dung dịch ADN.
Mẫu ảnh TEM được chuẩn bị bằng cách nhúng lưới đồng trong dung dịch CNT phân tán sau đó để khô. Từ hình 3.3 có thể quan sát thấy rằng, các ống nano các bon đã được phân tán đồng đều trong dung dịch ADN, không còn sự bó xoắn giữa các ống. Điều này khẳng định thêm rằng ống nano các bon được phân tán tốt trong dung dịch ADN.
3.1.2. Đặc trưng cố định ADN lên ống nano các bon
3.1.2.1. Ảnh FE-SEM của bề mặt ống nano các bon .
Ống nano các bon (CNT) sau khi được cốđịnh ADN sẽđược phủ lên bề mặt cảm biến. Hình thái bề mặt của cảm biến trước và sau khi cố định ADN được đặc trưng bằng kính hiển vi điện tử quét FE – SEM như được biểu diễn trong hình 3.4. Nhưđã được đề cập, chuỗi ADN liên kết đến bề mặt ống nano các bon thông qua sự
tương tác của lực Van Der Wall, lực ion, tương tác của liên kết π-π. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện hai thí nghiệm khác nhau để xem xét hình thái bề mặt của cảm biến.
Hình 3.4. Ảnh FE-SEM của bề mặt ống nano các bon không được cốđịnh ADN (a), được cốđịnh ADN (b)
Trong thí nghiệm đầu tiên, ống nano các bon không được cốđịnh ADN được phủ lên bề mặt cảm biến (hình 3.4 a). Có thể nhận thấy rằng, chỉ là các ống nano các bon với đường kính khác nhau nằm không có trật tự trên bề mặt của cảm biến.
Trong thí nghiệm thứ hai, ống nano các bon được cốđịnh chuỗi ADN sau đó phủ lên bề mặt cảm biến hình (3.4 b), có thể thấy rằng, bề mặt ống nano các bon đã có sự thay đổi, chuỗi ADN (những chấm trắng nhỏ) đã được liên kết với ống nano các bon. Tuy nhiên, chúng ta cũng có thể quan sát thấy mật độ ADN liên kết với bề
mặt CNT chưa được phân bố đều. Điều này sẽảnh hưởng không nhỏ tới tín hiệu lai hoá cũng như độ nhạy của vi cảm biến. Từ việc phân tích ảnh hiển vi điện tử quét chúng ta có thể quan sát định tính về sự liên kết chuỗi ADN với ống nano các bon ở
trên bề mặt cảm biến. Để có thể khẳng định khả năng liên kết của chuỗi ADN với
ống nano các bon, chúng tôi sử dụng phổ hồng ngoại sẽđược trình bày trong phần tiếp theo.
3.1.2.2. Đặc trưng phổ hồng ngoại FTIR của CNT-ADN
Tương tác giữa chuỗi ADN dò và ống nano các bon được đặc trưng bằng phổ
hồng ngoại FTIR như được biểu diễn trên hình 3.5. Đây là phổ hồng ngoại được nghiên cứu cho mẫu không được cố định ADN (hình 3.5 a) và được cố định ADN (hình 3.5 b).
Hình 3.5. Phổ FTIR ống nano các bon không được cốđịnh AND (a), được cố định ADN (b), 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
Quan sát trên hình 3.5a ta thấy xuất hiện đỉnh hấp phụ tại vị trí 1640 cm-1 của liên kết C = C và một số đỉnh nằm trong dải 1120 cm-1 đến 931cm-1 là của các liên kết N-H , O-H, C-H được tạo thành trong quá trình oxy hoá ống nano các bon. Khi có sự kết hợp giữa CNT và ADN sẽ làm xuất hiện thêm một sốđỉnh hấp phụ trong phổ
của mẫu ống nano các bon được cố định ADN (hình 3.5b). Phổ dao động trong miền tần số từ 1700 cm-1 đến 1600 cm-1 là của liên kết C = N, N-H, C = C. Trong dải này xuất hiện thêm hai đỉnh tại vị trí 1650 cm-1 và 1660 cm-1 là của hai nhóm bazơ trong chuỗi ADN[17]. Trong dải tần số từ 1600 cm-1đến 1000 cm-1 là liên kết của các nhóm: CH2 - O - P - O, N-H , O-H, C-H.[7]. Trong miền này xuất hiện đỉnh hấp phụ của nhóm phốt phát của chuỗi ADN tại vị trí 1210cm-1. Trong dải tần số
thấp từ 900cm-1 đến 750cm-1 được xem như là phổ của các gốc đường trong chuỗi ADN[15].
3.1.2.3. Đặc trưng phổ Raman
Trong phần này chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự tương tác của chuỗi ADN lên trên bề mặt ống nano các bon thông qua nghiên cứu phổ Raman của hai mẫu thí nghiệm, một mẫu CNT không được cố định ADN, một mẫu CNT được cố định ADN. (Hình 3.6).
Quan sát phổ Raman của mẫu ống nano không được cốđịnh ADN ta thấy có hai dải phổ đặc trưng là dải D và G. Dải D xung quanh vị trí 1329 cm-1 và dải G xung quanh vị trí 1583 cm-1. Đối với mẫu ống nano đã cốđịnh ADN ta thấy có sự
dịch đỉnh của các phổ so với phổ của ống nanno các bon không được cốđịnh ADN, cụ thể là sự dịch đỉnh hấp thụ dải D từ 1329 cm-1đến 1335 cm-1, và dải G từ 1583 cm-1đến 1581cm-1.
Hình 3.6. Phổ raman ống nano các bon được cố định DNA và ống nano các bon không được cốđịnh DNA. 30ml dung dịch ADN, 15mg SWCNTs, pH7.
Sự dịch chuyển này có thể được giải thích là do sự hấp phụ của ADN lên bề mặt
ống nano các bon dẫn đến sự di chuyển điện tích âm nhóm phốt phát của ADN tới
ống nano các bon làm cho cấu trúc điện tử của ống nano các bon bị thay đổi.
Như vậy thông qua khảo sát phổ FTIR và Raman của ống nano các bon đã cố định ADN và ống nano các bon không được cốđịnh ADN ta có thể kết luận rằng đã có sự hấp phụ của ADN lên ống nano các bon trong mẫu khảo sát.
3.2. Đặc trưng đáp ứng của cảm biến ADN 3.2.1.Đặc trưng đáp ứng ra của cảm biến 3.2.1.Đặc trưng đáp ứng ra của cảm biến
Sau khi thực hiện quá trình cố định ADN lên ống nano các bon, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các đặc trưng của cảm biến cũng như các yếu tố ảnh hưởng của quá trình cốđịnh ADN đến tín hiệu ra của cảm biến. Các số liệu thí nghiệm sẽđược trình bày trong những phần tiếp theo.
3.2.1.1. Thời gian đáp ứng của cảm biến.
Sau quá trình cố định ADN dò lên bề mặt cảm biến chúng tôi tiến hành nghiên cứu thời gian đáp ứng của cảm biến thông qua các phép đo lai hoá với chuỗi ADN bổ sung sử dụng máy lock in SR830. Để xác định thời gian đáp ứng của cảm biến chúng tôi sử dụng mẫu cảm biến đã được cốđịnh ADN dò với nồng độ 10 µM,