để thực hiện ựược nghiên cứu này, chúng tôi ựã tiến hành phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic từ 3 mẫu mắm tôm chua, bao gồm mẫu mắm tôm chua Thái Bình, mẫu mắm tôm chua Huế và mẫu cà dầm tôm (một dạng sản phẩm khác của mắm tôm chua).
Quá trình phân lập VK lactic từ mẫu ựược tiến hành trên môi trường MRS. đây là một môi trường ưa thắch và gần như ựặc hiệu ựối với VK lactic, các VK khác hầu như rất khó phát triển.
Sử dụng phương pháp phân lập VSV cơ bản, chúng tôi ựã phân lập ựược 6 dạng hình thái khuẩn lạc khác nhau, ựược ựặt tên lần lượt là NB1 ọ NB6. 6 chủng VK này ựược chúng tôi nuôi cấy tách riêng nhau ựể tạo ựộ thuần nhất ựịnh trên môi trường thạch MRS. Sau ựó chúng lần lượt ựược nuôi trong môi trường MRS lỏng, ở 30 oC trong 24 giờ ựể kiểm tra sự có mặt của acid lactic trong dịch nuôi cấy. Kết quả thắ nghiệm ựược phân tắch ở bảng như sau:
Bảng 4.1: Kết quả phân lập 6 chủng VK từ mắm tôm chua Chủng
Chỉ tiêu
NB1 NB2 NB3 NB4 NB5 NB6
Sinh trưởng trên môi
trường thạch MRS (+) (+) (+) (+) (+) (+) pH môi trường Giấy quỳ tắm hóa hồng ựỏ Giấy quỳ tắm hóa xanh Giấy quỳ tắm hóa xanh Giấy quỳ tắm hóa xanh Giấy quỳ tắm hóa hồng ựỏ Giấy quỳ tắm hóa xanh Acid Acid
Nhận biết acid lactic
Như vậy, từ 3 mẫu thu thập, chúng tôi bước ựầu ựã phân lập ựược 2 chủng VK, ựặt trên là NB1 và NB5. 2 chủng VK này có 2 ựặc ựiểm quan trọng:
Sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường thạch MRS.
Có khả năng sinh acid lactic.
Hai chủng NB1 và NB5 ựược tiến hành tinh sạch và giữ giống trên môi trường thạch MRS và môi trường MRS lỏng ở ựiều kiện lạnh thường ựể tiếp tục tiến hành các thắ nghiệm sau.
4.2. Kết quả tìm hiểu ựặc tắnh sinh học của các chủng VK sinh acid lactic
Tìm hiểu ựặc tắnh sinh học của 2 chủng NB1 và NB5 nhằm bước ựầu xác ựịnh ựơn vị phân loại của chủng VK. để có thể sơ bộ ựánh giá, chúng tôi thực hiện các thắ nghiệm sau ựây:
Gram của VK.
Hoạt tắnh catalase.
Kiểu lên men của VK.
Hoạt tắnh protease.
Khả năng sinh acid lactic.
Khả năng ựồng hóa các loại ựường.
4.2.1. Thắ nghiệm 2.1. Tìm hiểu ựặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của các chủng lựa chọn.
Sau khi phân lập ựược 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng sinh acid lactic, chúng tôi tiếp tục tiến hành thắ nghiệm xác ựịnh ựặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của chúng. Bằng phương pháp cấy trang dịch pha loãng ở nồng ựộ 10 -6 trên môi trường thạch MRS, nuôi cấy ở 30oC và theo dõi ở các thời ựiểm: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, sau 72 giờ, chúng tôi thu ựược kết quả ựược phân tắch ở bảng như sau:
Bảng 4.2: đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5
Chủng
Giờ theo dõi
Hình thái khuẩn lạc Chủng NB1
Hình thái khuẩn lạc Chủng NB5
24 giờ nuôi cấy
- Kắch thước ựường kắnh trung bình: 0.8 Ờ 0.9 (mm).
- Hình dáng: Hình tròn. - Màu sắc: Màu trong.
- Kắch thước ựường kắnh trung bình: 1.1 Ờ 1.3 (mm).
- Hình dáng: Hình tròn. - Màu sắc: Màu trắng ựục
48 giờ nuôi cấy
- Kắch thước ựường kắnh trung bình: 1.5 Ờ 2.5 (mm).
- Hình thái: Hình tròn.
- đặc ựiểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên lồi nhiều.
- Màu sắc: Trắng sữa pha vàng.
- Kắch thước ựường kắnh trung bình: 1.7 Ờ 2.5 (mm). - Hình thái: Hình tròn.
- đặc ựiểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên hơi lồi.
- Màu sắc: Trắng ựục.
Sau 72 giờ nuôi cấy
- Kắch thước ựường kắnh trung bình ựạt mức ổn ựịnh ở 2.0 Ờ 3.5 (mm).
- Hình thái: Hình tròn.
- đặc ựiểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên lồi nhiều. Bề mặt dưới hoàn toàn không ăn sâu vào môi trường. - Màu sắc: Màu trắng sữa pha
vàng - Kắch thước ựường kắnh trung bình ựạt mức ổn ựịnh ở 2.3 Ờ 3.3 (mm). - Hình thái: Hình tròn. - đặc ựiểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên hơi lồi. Bề mặt dưới hoàn toàn không ăn sâu vào môi trường.
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của chủng NB1
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của chủng NB5
Sơ bộ xác ựịnh ựược ựặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5 như sau:
đặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của chủng NB1: o Khuẩn lạc hình tròn, trơn, bóng, nhẵn, lồi.
o Khuẩn lạc màu trắng sữa pha vàng.
o Khi ổn ựịnh về kắch thước, ựường kắnh khuẩn lạc ựạt khoảng 2.0 Ờ 3.5 (mm).
đặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của chủng NB5: o Khuẩn lạc hình tròn, trơn, bóng, nhẵn, lồi.
o Khuẩn lạc màu trắng ựục.
4.2.2. Thắ nghiệm 2.2. đặc ựiểm hình thái học tế bào của 2 chủng ựã phân lập.
Sau khi xác ựịnh hình thái, kắch thước, ựặc ựiểm khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5, chúng tôi tiếp tục chuyển sang phần thứ hai của thắ nghiệm ựánh giá hình thái, ựó là quan sát và nhận biết hình thái, ựặc ựiểm tế bào học của 2 chủng NB1 và NB5.
Như ựã trình bày ở trên, bằng phương pháp nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy tế bào của cả 2 chủng NB1 và NB5 ựều bắt màu tắm của thuốc nhuộm (Tắm gentian). điều ựó chứng tỏ 2 chủng NB1 và NB5 thuộc VK Gram dương (+). Kết quả của thắ nghiệm ựược minh họa bằng hình ảnh sau:
Hình 4.3: Ảnh chụp tiêu bản nhuộm tế bào của chủng NB1
4.2.3. Thắ nghiệm 2.3. Hoạt tắnh catalase của 2 chủng NB1 và NB5.
Trong quá trình quan sát và theo dõi hình thái học khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5, ựồng thời tiến hành thử hoạt tắnh catalase của chúng. Kết quả ựược phân tắch như sau:
Khi nhỏ 1 giọt nước oxy già (H2O2) lên bề mặt khuẩn lạc VK, chúng tôi quan sát thấy không có hiện tượng gì xảy ra (không sủi bọt trên bề mặt khuẩn lạc) ựối với cả 2 chủng NB1 và NB5. Như vậy:
→ 2 chủng NB1 và NB5 không có khả năng phân giải H2O2 (ựể giải phóng O2), nghĩa là chúng không có hoạt tắnh catalase (-).
→ điều ựó chứng tỏ, 2 chủng NB1 và NB5 là VK kỵ khắ.
4.2.4. Thắ nghiệm 2.4. Xác ựịnh kiểu lên men của 2 chủng nghiên cứu.
Theo kiến thức về 2 kiểu lên men ựồng hình và dị hình, ta biết rằng trong quá trình sinh trưởng của VK lên men dị hình có sinh khắ CO2 Ầ điều này là cơ sở tiến hành xác ựịnh kiểu lên men của 2 chủng ựã phân lập.
Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS (pH 6.5 ổ 0.2, to = 30 oC), ựặt thêm các ống Dunham vào ống nghiệm và theo dõi quá trình lên men. Quan sát quá trình nuôi cấy thấy:
Sau 24 giờ nuôi cấy, kiểm tra pH của dịch lên men thấy quỳ tắm hóa hồng Ờ ựỏ, nghĩa là pH của dịch ựạt acid, chứng tỏ ựã có sự sinh trưởng của VK và tạo thành acid lactic, làm acid hóa môi trường.
Mặt khác, quan sát thấy ống Dunham trong ống nghiệm không nổi lên, không có bọt khắ trong ống Dunham cũng như ở dịch nuôi cấy, không thấy sủi bọt.
Như vậy, 2 chủng NB1 và NB5 ựều sinh trưởng, sinh ra acid làm acid hóa dịch nuôi cấy, nhưng quá trình lên men không sinh ra khắ (CO2 Ầ). điều ựó giúp chúng tôi sơ bộ kết luận rằng, quá trình lên men của 2 chủng NB1 và NB5 là lên men ựồng hình. Chúng thực hiện lên men ựồng hình theo phản ứng sau:
C6H12O6 2 CH3-CHOH-COOH + 94 kcal. (glucose) (acid lactic)
4.2.5. Thắ nghiệm 2.5. Hoạt tắnh protease của các chủng nghiên cứu.
Theo phương pháp thử hoạt tắnh protease, chúng tôi sử dụng môi trường có bổ sung cơ chất casein. Kết quả cho thấy 2 chủng NB1 và NB5 có hoạt tắnh protease, nhưng vòng tròn hoạt tắnh protease (D Ờ d, mm) rất bé, chứng tỏ hoạt tắnh không mạnh.
4.2.6. Thắ nghiệm 2.6. Khả năng ựồng hóa các loại ựường của 2 chủng NB1 và NB5.
để tìm hiểu khả năng ựồng hóa các loại ựường, chúng tôi sử dụng 3 loại ựường phục vụ thắ nghiệm này là: saccharose, maltose, galactose (bên cạnh glucose ựã là thành phần tiêu chuẩn cho môi trường MRS).
Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS lỏng (pH 6.5 ổ 0.2, to = 30 oC), thay thế lần lượt ựường vào thành phần môi trường MRS với tỷ lệ tương ựương, chúng tôi theo dõi và ựánh giá các chỉ tiêu cơ bản (pH dịch lên men, sự có mặt của acid lactic) sau 24 giờ nuôi cấy. Kết quả ựược phân tắch ở bảng như sau:
Bảng 4.3: Khả năng ựồng hóa các loại ựường của 2 chủng NB1 và NB5
Chủng đường
NB1 NB5
pH Acid lactic pH Acid lactic
Glucose Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+) Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+)
Saccharose Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+) Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+)
Maltose Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+) Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+)
Galactose Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+) Giấy quỳ tắm hóa ựỏ (+)
Chú thắch: (+) Tồn tại acid lactic trong dịch nuôi cấy
Có thể thấy rằng, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng ựồng hóa 4 loại ựường cơ bản trên, chúng sinh trưởng và sinh ra acid lactic, làm acid hóa môi trường. điều này sẽ làm cơ sở khi sản xuất bởi có thể thay ựường mắa cho glucose.
4.2.7. Sơ bộ ựịnh danh cho các chủng vi khuẩn ựã tuyển chọn
Tổng hợp các kết quả của các thắ nghiệm trên, chúng tôi rút ra các ựặc ựiểm sinh học của 2 chủng NB1 và NB5 ựược phân lập từ mắm tôm chua như sau:
Bảng 4.4: đặc ựiểm phân loại học 2 chủng NB1 và NB5 Chủng đặc ựiểm NB1 NB5 Gram (+) (+) Hoạt tắnh catalase (-) (-) Mẫn cảm với O2 Kỵ khắ Kỵ khắ
Khả năng sinh acid lactic (+), không sinh khắ (+), không sinh khắ
Kiểu lên men Lên men ựồng hình Lên men ựồng hình
Hình thái tế bào Cầu khuẩn, tạo chuỗi Trực khuẩn, ựứng
ựơn, xếp ựôi
Hoạt tắnh protease (+), yếu (+), yếu
Khả năng ựồng hóa các loại ựường:
Glucose Saccharose Maltose Galactose (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
Chú thắch: (+) Cho kết quả dương tắnh. (-) Cho kết quả âm tắnh.
Như vậy, theo khóa phân loại Bergey, chúng tôi sơ bộ xếp 2 chủng NB1 và NB5 là 2 chủng VK lactic, NB1 là loài Streptococcus, NB5 là loài Lactobacillus.
4.3. Kết quả tìm hiểu một số ựiều kiện nuôi cấy VK lactic ựã tuyển chọn.
Sau khi tìm hiểu các ựặc tắnh sinh học của 2 chủng VK lactic NB1 và NB5, chúng tôi tiếp tục tìm hiểu về ảnh hưởng của một số ựiều kiện nuôi cấy ựến sự sinh trưởng của VK lactic, từ ựó tìm hiểu quá trình tạo thành acid lactic và bacterioxin của chúng.
Như vậy, khắa cạnh này ựược chúng tôi ựánh giá ở các nội dung sau:
Tìm hiểu ựường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (ựược tiến hành ở thắ nghiệm 3.1).
Tìm hiểu sự tạo thành acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 (ựược tiến hành ở thắ nghiệm 3.2).
Tìm hiểu sự tạo thành bacterioxin của 2 chủng NB1 và NB5 (ựược tiến hành ở thắ nghiệm 3.3).
sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (ựược tiến hành ở thắ nghiệm 3.4; 3.5).
4.3.1. Thắ nghiệm 3.1. Xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của VK lactic phân lập từ nguồn mắm tôm chua.
Xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 giúp ta kiểm soát ựược quá trình nuôi cấy và xác ựịnh ựược thời gian thắch hợp nhất cho quá trình thu sinh khối. Ngoài ra, ta có thể sơ bộ xác ựịnh mối quan hệ giữa quá trình sinh trưởng, phát triển của VK lactic với khả năng sinh acid lactic, khả năng ức chế khuẩn của chúng.
Chúng tôi tiến hành xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 trên môi trường lỏng MRS, pH 6.5 trong tủ nuôi ổn nhiệt ở nhiệt ựộ 30 oC. Mẫu ựược ựo OD ựến thời ựiểm 96 giờ sau khi nuôi cấy, cứ 4 giờ nuôi cấy lấy mẫu một lần ựo OD, mỗi lần ựo ựược nhắc lại 3 lần. Sau ựó, sử dụng phương pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel. Kết quả theo dõi trị số ựo OD khi nuôi cấy chủng NB1 và NB5 ựược thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.5: Khả năng sinh trưởng của 2 chủng VK lactic xác ựịnh qua trị số ựo OD620 nm
OD620 TRUNG BÌNH
Chủng
Thời gian NB1 NB5
04 giờ nuôi cấy 0.244 0.301
08 giờ nuôi cấy 0.540 0.695
12 giờ nuôi cấy 0.920 1.013
16 giờ nuôi cấy 1.231 1.321
20 giờ nuôi cấy 1.588 1.643
24 giờ nuôi cấy 1.854 1.976
28 giờ nuôi cấy 2.019 2.249
32 giờ nuôi cấy 2.029 2.340
36 giờ nuôi cấy 2.043 2.407
40 giờ nuôi cấy 2.059 2.410
44 giờ nuôi cấy 2.078 2.413
48 giờ nuôi cấy 2.080 2.409
52 giờ nuôi cấy 2.043 2.389
56 giờ nuôi cấy 2.010 2.298
60 giờ nuôi cấy 1.980 2.289
Kết quả trên ta xây dựng ựược ựường chuẩn của chủng NB1 ựược thể hiện như sau:
đường cong sinh trưởng của chủng NB1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
Thời gian nuôi cấy (h)
M ứ c ự ộ s in h t rư ở n g ự o b ằn g g iá tr ị O D 62 0 n m
Biểu ựồ 4.1: đường cong sinh trưởng của chủng NB1
Như vậy, dựa vào bảng số liệu và ựồ thị ựường cong sinh trưởng của chủng NB1, chúng tôi sơ bộ ựưa ra một số nhận xét sau:
Chủng NB1 phát triển mà bỏ qua giai ựoạn thắch ứng. điều này ựược giải thắch do môi trường hoạt hóa giống và môi trường lên men là giống nhau Ờ Môi trường MRS dịch thể.
Giai ựoạn phát triển của chủng NB1 khá dài, tắnh ựến khoảng 24 Ờ 28 giờ sau nuôi cấy.
Chủng NB1 ựạt pha cân bằng ở khoảng 28 giờ sau nuôi cấy.
Giai ựoạn cân bằng ở chủng NB1 diễn ra khá dài, từ khoảng 28 Ờ 48 giờ sau nuôi cấy. điều này chứng tỏ chủng NB1 có khả năng duy trì phát triển tốt.
Mật ựộ tế bào ựạt giá trị cực ựại khoảng 40 Ờ 48 giờ sau nuôi cấy.
Từ 48 giờ trở ựi, tế bào chủng NB1 bắt ựầu già hóa và chết dần.
Phương pháp nghiên cứu xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của chủng NB1 ựược chúng tôi tiếp tục áp dụng với chủng NB5, kết quả thu ựược ựược thể hiện bằng bảng
số liệu và biểu ựồ như sau: đng cong sinh trng ca chng NB5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72
Thời gian nuôi cấy (h)
M ứ c ự ộ s in h t rư ở n g ự o b ằ n g g iá t rị O D 6 2 0 n m
Biểu ựồ 4.2: đường cong sinh trưởng của chủng NB5
Tương tự, dựa vào bảng số liệu và ựồ thị ựường cong sinh trưởng của chủng NB5, chúng tôi ựánh giá một vài nhận xét như sau:
Chủng NB5 phát triển mà bỏ qua giai ựoạn thắch ứng với môi trường lên men. điều này cũng ựược giải thắch giống như ở trường hợp nuôi cấy chủng NB1 do môi trường hoạt hóa giống và môi trường lên men là giống nhau Ờ Môi trường MRS dịch thể.
Giai ựoạn phát triển của chủng NB5 khá dài, tắnh ựến khoảng 28 Ờ 32 giờ sau nuôi cấy.
Chủng NB5 ựạt pha cân bằng ở khoảng 36 giờ sau nuôi cấy.
Giai ựoạn cân bằng ở chủng NB5 diễn ra khá dài, từ khoảng 36 Ờ 52 giờ sau nuôi cấy. điều này chứng tỏ chủng NB5 có khả năng duy trì phát triển tốt.
Mật ựộ tế bào ựạt giá trị cực ựại khoảng 40 Ờ 48 giờ sau nuôi cấy.
Từ 52 giờ trở ựi, tế bào chủng NB1 bắt ựầu già hóa và chết dần.
4.3.2. Khả năng sinh acid lactic của các chủng VK lactic phân lập từ mắm tôm chua.