Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu về VK lactic và các ứng dụng của chúng sử dụng trong công nghệ thực phẩm vẫn còn khá mới mẻ. Chủ yếu, các nghiên cứu ựược công bố chủ yếu chỉ dừng ở việc phân lập, tuyển chọn và ựánh giá các chủng VK lactic từ những nguồn mẫu như: nem chua, sữa chuaẦ
Người ta ựã phân lập và tuyển chọn thành công 2 giống Streptococcus. sp và
Lactobacillus. sp từ chế phẩm Probiotic. 2 chủng này ựều là là VK gram dương (+), không có khả năng di ựộng, không có hoạt tắnh catalase, có khả năng ựồng hóa các loại ựường. 2 chủng này có hoạt tắnh sinh acid lactic mạnh, có khả năng chịu mặn ở ựộ mặn 5 % [8], [18].
chi Lactobacillus. 10 chủng tuyển chọn ựều sinh acid lactic cao (trên 200 oT), hoạt tắnh ức chế Vk tốt, khả năng phân giải protein mạnh [30].
Mặt khác, nhằm ứng dụng lên men lactic trong sản xuất chế phẩm probiotic, người ta ựã phân lập và tuyển chọn ựược 3 chủng VK lactic thuộc chi Lactobacillus có hoạt tắnh sinh acid lactic cao, sinh trưởng tốt trên môi trường cải tiến rẻ tiền, có thể thay thế cho môi trường MRS nhiều hóa chất ựắt tiền, khó kiếm [8], [22].
Với ứng dụng lên men lactic trong sản xuất bột cá nhạt, người ta ựã xác ựịnh ựược một số ựặc ựiểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng Lactobacillus. sp. đây là một trực khuẩn, không sinh bào tử, không có khả năng chuyển ựộng, lên men lactic ựồng hình. đồng thời, người ta ựã tìm ựược môi trường cải tiến, có tắnh kinh tế hơn, trong ựó thay thế môi trường MRS bằng nước mắm, nước bắp cải, ựường và peptone [20].
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. đối tượng nghiên cứu
- VK lactic tham gia quá trình lên men lactic trong mắm tôm chua. - VSV chỉ thị: Chủng Bacillus sp. Chủng E. Coli Chủng Salmonella sp. Chủng Pseudomonas sp. Chủng Staphylococcus ỘtrắngỢ Chủng Staphylococcus ỘvàngỢ 3.1.2. Hóa chất
Trong quá trình làm thắ nghiệm, chúng tôi ựã sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau. Nhìn chung, chúng ựược chia làm các nhóm chắnh như sau:
Nhóm hóa chất pha môi trường: o Agar (Việt Nam).
o Calcium carbonate Ờ CaCO3 (Trung Quốc). o Nutrient Agar (đức).
o Dipotassium hydrogen phosphate Ờ K2HPO4 (Trung Quốc). o Meat extract Ờ Cao thịt (đức).
o Yeast extract Ờ Cao nấm men (đức).
o Triamomonium citrate Ờ (NH4)3C6H5O7 (Trung Quốc).
o Magnesium sulfate heptahydrate Ờ MgSO4 . 7 H2O (Trung Quốc). o Mangan sulfate tetrahydrate Ờ MnSO4 . 4 H2O (đức).
o Peptone (Trung Quốc).
o Sodium acetate anhydrous Ờ CH3COONa (Trung Quốc). o Sodium chloride Ờ NaCl (Trung Quốc).
o Tween 80 (Trung Quốc).
Nhóm hóa chất nhuộm: o Phenic acid: C6H6O. o Lugol: I2 + KI. o Tắm gential. o Fucxin. Nhóm hóa chất khác:
o Sodium hydroxide Ờ NaOH (Trung Quốc). o Hydrogen chloride Ờ HCl (Trung Quốc).
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình thực tập tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện tại nhiều phòng thắ nghiệm khác nhau. Mỗi phòng thắ nghiệm ựược trang bị những dụng cụ, thiết bị hiện ựại khác nhau. Những thiết bị ựược chúng tôi sử dụng bao gồm:
Máy khuấy từ gia nhiệt Ờ ARE Italia.
Cân phân tắch Mettler Toledo Ờ FB 602 S/FACT.
Cân kỹ thuật Mettler Toledo Ờ AB 204 S/FACT.
Máy ựo quang phổ Ờ LIUV 310S.
Tủ nuôi ổn nhiệt JSR Ờ JSRI 150C.
Máy ựo pH bàn Ờ pH Meter S20.
Máy ựo pH cầm tay Ờ pH Meter SG2.
Tủ sấy dụng cụ JSR Ờ OF 100.
Máy ly tâm lạnh Ờ Hettich Model 320.
Kắnh hiển vi Leica Ờ ADM 750.
Lò vi sóng Sanyo Ờ EMG 4777S.
Nồi hấp.
Tủ lạnh thường Panasonic.
Tủ cấy vô trùng Ờ JSCB 1500 SB.
Bên cạnh ựó, chúng tôi cũng sử dụng những dụng cụ thắ nghiệm cơ bản như sau:
Eppendorf Research các loại: 0.1 Ờ 2.5 ộl; 0.5 Ờ 10 ộl; 2 Ờ 20 ộl; 10 Ờ 100 ộl; 1000 Ờ 5000 ộl Ầ
Ống nghiệm.
đĩa Petri.
Dụng cụ bằng thủy tinh khác: đèn cồn, các loại cốc thủy tinh (ứng với các mức thể tắch), các loại bình cầu ựáy bằng và tròn (ứng với các mức thể tắch), các loại bình tam giác (ứng với các mức thể tắch), các loại ống ựong (ứng với các mức thể tắch), ống hút.
Que cấy bao gồm: que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy tam giác.
3.1.4. Môi trường cơ bản sử dụng cho nghiên cứu
Trong quá trình thực tập tốt nghiệp, chúng tôi ựã thực hiện tại nhiều phòng thắ nghiệm khác nhau, trên nhiều lĩnh vực khác nhau (như hóa học, sinh học VSV thực phẩm, sinh học VSV thú y Ầ). Chắnh vì vậy, môi trường ựược sử dụng trong các thắ nghiệm là rất nhiều ựể phục vụ mục ựắch của từng thắ nghiệm. Tổng hợp những môi trường (bao gồm thành phần môi trường) ựược sử dụng trong ựề tài này gồm có:
Môi trường LB: Peptone Cao nấm men NaCl Agar 10 g/l 5 g/l 8 g/l 20 g/l pH 7.0 ổ 0.2 Môi trường MRS: Peptone Cao thịt Cao nấm men Glucose
Tri Ờ ammonium citrate
Magnesium sulfate heptahydrate
10 g/l 10 g/l 5 g/l 20 g/l 2 g/l 0.2 g/l
Dipotassium hydrogen phosphate Mangan sulfate tetrahydrate Tween 80 Agar 2 g/l 0.05 g/l 1 ml/l 20 g/l pH 6.5 ổ 0.2
Chú ý: Tùy từng thắ nghiệm mà chúng tôi không bổ sung Agar (môi trường lỏng), bổ sung CaCO3 với hàm lượng 0.05 % khối lượng (xác ựịnh khả năng sinh acid), hoặc thay thế glucose bằng saccharose, maltose, galactose (xác ựịnh khả năng ựồng hóa các loại ựường).
Môi trường thạch ựá vôi: Agar
Calcium carbonate
20 g/l 0.05 % pH 7.0 ổ 0.2
Môi trường thạch dinh dưỡng: Peptone Meat extract Sodium chloride Agar 5.0 g/l 2.0 g/l 1.0 g/l 20 g/l pH 7.0 ổ 0.2
3.2. địa ựiểm nghiên cứu
Trong toàn bộ quá trình thực tập, chúng tôi ựã tiến hành tất cả các thắ nghiệm tại các phòng thắ nghiệm sau:
Phòng thắ nghiệm Công nghệ Vi sinh Ờ Khoa Công nghệ Sinh học, đH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thắ nghiệm Công nghệ Môi trường Ờ Khoa Tài nguyên & Môi trường, đH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thắ nghiệm BM. Vi sinh vật & Truyền nhiễm Ờ Khoa Thú Y, đH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thắ nghiệm BM. Di truyền giống Ờ Khoa Chăn nuôi Thú y, đH Nông nghiệp Hà Nội.
3.3. Thời gian nghiên cứu: 15/02/2010 Ờ 31/07/2010.
Quá trình thực tập ựược ghi lại trong sổ nhật ký thực tập.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Các thắ nghiệm
3.4.1.1. Thắ nghiệm 1.1: Phân lập các chủng VK trên môi trường MRS dựa theo khả năng sinh acid lactic.
a. Mẫu thu thập
- Mắm tôm chua Thái Bình. - Mắm tôm chua Huế. - Mắm cà dầm tôm. b. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS, môi trường MRS dịch thể. - điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ựĩa Petri, ống nghiệm. c. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng trên môi trường MRS. - Sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy VK.
- Nhận biết sự có mặt của acid lactic trong dịch nuôi cấy VK.
3.4.1.2. Thắ nghiệm 2.1: Tìm hiểu ựặc ựiểm hình thái học khuẩn lạc của VK có khả năng sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS. - điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên ựĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay ựổi kắch thước trung bình khuẩn lạc theo thời gian. - Sự thay ựổi hình dạng khuẩn lạc theo thời gian..
- Sự thay ựổi màu sắc khuẩn lạc theo thời gian.. - đặc ựiểm khuẩn lạc theo thời gian.
3.4.1.3. Thắ nghiệm 2.2: Tìm hiểu ựặc ựiểm hình thái học tế bào của VK có khả năng sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 1000 lần. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Xác ựịnh Gram của VK.
- Xác ựịnh hình dạng, kắch thước của VK.
3.4.1.4. Thắ nghiệm 2.3: Tìm hiểu hoạt tắnh catalase của VK có khả năng sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy khuẩn lạc: môi trường thạch MRS.
- điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 48 (h). - Hóa chất thử hoạt tắnh catalase: Nước oxy già (H2O2).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bề mặt khuẩn lạc. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tắnh bằng mắt thường.
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tắnh bằng kắnh hiển vi.
3.4.1.5. Thắ nghiệm 2.4: Tìm hiểu kiểu lên men của VK có khả năng sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể.
- điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h). - Số lần nhắc lại: 3 lần trên ựĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH của dịch lên men theo thời gian. - Sự thay ựổi trong ống Dunham.
3.4.1.6. Thắ nghiệm 2.5: Tìm hiểu hoạt tắnh protease của VK có khả năng sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường thử hoạt tắnh protease. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh protease của VK lactic.
3.4.1.7. Thắ nghiệm 2.6: Tìm hiểu khả năng ựồng hóa các loại ựường của VK sinh acid lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- đường phục vụ nghiên cứu: glucose, saccharose, maltose, galactose.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung thành phần ựường khác nhau.
- điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ống nghiệm. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH dịch lên men theo thời gian.
- Xác ựịnh sự tồn tại của acid lactic trong dịch lên men.
3.4.1.8. Thắ nghiệm 3.1: Xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của VK lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể. - điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC. - đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay ựổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.9. Thắ nghiệm 3.2.1: Xác ựịnh ựịnh tắnh khả năng sinh acid lactic của VK lactic ựược phân lập.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 0.05 %. - điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ựĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự sinh trưởng của khuẩn lạc của VK theo thời gian ựo bằng ựộ ựục OD ở bước sóng 620 nm.
- Sự thay ựổi của vòng tròn hoạt tắnh xung quanh khuẩn lạc theo thời gian. - Sự biến thiên của bán kắnh vòng tròn hoạt tắnh (D Ờ d, mm) theo thời gian.
3.4.1.10. Thắ nghiệm 3.2.2: Xác ựịnh ựịnh lượng khả năng sinh acid lactic của VK lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng. - điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần theo phương pháp trung hòa NaOH. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Lượng (ml) NaOH 0.1 N trung bình ựã sử dụng ựể trung hòa 100 (ml) dung dịch mẫu.
- Lượng acid lactic (g/100 ml mẫu) có trong mẫu.
3.4.1.11. Thắ nghiệm 3.3: Xác ựịnh khả năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC (ựối với môi trường LB), 37 ổ 2.0oC (ựối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus ỘtrắngỢ; Staphylococcus ỘvàngỢ.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ựĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
3.4.1.12. Thắ nghiệm 3.4: Tìm hiểu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt ựộ ựến sự sinh trưởng của VK lactic ựược phân lập.
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng.
- điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ổ 0.2, các ựiều kiện nhiệt ựộ khác nhau. - đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng bằng ựo ựộ ựục trên máy so màu OD620 (bước sóng 620 nm, kắnh lọc màu ựỏ).
3.4.1.13. Thắ nghiệm 3.5: Tìm hiểu ảnh hưởng của nồng ựộ muối ựến sự sinh trưởng của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung NaCl ở các nồng ựộ khác nhau.
- điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC .
- đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian ựể xác ựịnh khả năng sinh trưởng.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng
- Sự thay ựổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.14. Thắ nghiệm 4.1: Tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn ựơn loài của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ổ 0.2, to 30 ổ 2.0 oC (ựối với môi trường LB), 37 ổ 2.0oC (ựối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus ỘtrắngỢ; Staphylococcus ỘvàngỢ.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Kắch thước bán kắnh vòng tròn kháng khuẩn (D Ờ d, mm) ựối với từng chủng.
3.4.1.15. Thắ nghiệm 5.1: Tìm hiểu sự thay ựổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thắ nghiệm
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo 2 phương pháp: truyền thống và bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- đánh giá các chỉ tiêu ựịnh kỳ 5 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay ựổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu ựộ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay ựổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.1.16. Thắ nghiệm 5.2: Tìm hiểu phương pháp làm mắm tôm chua cải tiến trên quy mô phòng thắ nghiệm
a. Bố trắ thắ nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo phương pháp cải tiến có bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- đánh giá các chỉ tiêu ựịnh kỳ 3 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay ựổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu ựộ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay ựổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay ựổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
lý và các bước tiến hành của các phương pháp nghiên cứu VSV nói chung [6], [7], [8]. Các phương pháp cơ bản ựó bao gồm:
Phương pháp phân lập VSV.
Phương pháp nuôi cấy và bảo quản VSV.
Phương pháp nhuộm Gram và quan sát ựặc ựiểm hình thái học tế bào VSV.
Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh catalase của VSV.
Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh protease của VSV.
Phương pháp xác ựịnh khả năng ựồng hóa các loại ựường của VSV.