3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.2.Vật liệu nghiên cứu
3.1.2.1. Mẫu bệnh
Mẫu lá cây hoa loa kèn trắng, loa kèn ựỏ, ly bị nhiễm bệnh.
3.1.2.2. Cây chỉ thị
Potyvirus trên hoa loa kèn ựỏ: thuốc lá (Nicotiana tabacum var. Xanthi),
bắ ngồi, hoa huệ, hoa loa kèn ựỏ (Hippeastrum sp.), ựậu tương (Glycine max), ựậu ựũa (Vigna sinensis cv. Black Eye), ựậu ựen (Vigna unguiculata ), ựậu cô ve (Phaseolus vulgaris).
3.1.2.3. Các ựệm, dung dịch, kắt, hóa chất và môi trường chắnh
Ớ RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (hãng Fermentas):
kắt tổng hợp sợi cDNA
Ớ ReverseDreamTaq (Fermentas): DNA polymerase chịu nhiệt
Ớ AccuPrep Plasmid Extraction Kit (Bioneer): kắt tinh chiết plasmid
Ớ AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer): kit thôi gel
Ớ Tripure (Roche): kắt tinh chiết RNA tổng số
Ớ BamHI và ECoRI (Fermentas): enzyme cắt giới hạn
Ớ đệm 0.5X TAE dùng ựiện di: 5mM Tris-acetate và 0.25mM EDTA (pH 7.8).
Ớ đệm photphat 0.1M, pH 7.4: lây nhiễm bệnh nhân tạọ
Ớ Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1): loại bỏ lipid and protein trong tinh
chiết RNẠ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 22
Ớ Môi trường LB lỏng (1L): cân 10g Tryptone, 5g cao nấm men và 5g NaCl.
điều chỉnh pH tới 7.0 bằng NaOH và hấp.
Ớ Môi trường LB ựặc chứa ampicillin (100 ộg/mL): cho 15g agar vào 1L môi trường LB lỏng. Hấp vô trùng. để môi trường nguội (~50ồC) và bổ sung ampicillin tới nồng ựộ 100 ộg/mL. Rót môi trường ra ựĩa petri vô trùng. để môi trường ựông lại và ựể khô bề mặt khoảng 30 phút trước khi bọc và bảo quản ở 4ồC (khoảng 1 tháng).
Ớ Môi trường SOB ựể chuẩn bị tế bào khả biến (1L): 20g Tryptone, 5g cao
nấm men, 10mL 1M NaCl, 2.5mL 1M KCl, 10mL dung dịch gốc 2M Mg2+
(MgCl2.6H2O & MgSO4.7H2O). Hấp vô trùng.
Ớ Môi trường SOC ựể chuẩn bị tế bào khả biến: Cho 1mL dung dịch 2M glucose vào 100mL môi trường SOB. Hấp vô trùng.
3.1.2.4. Tế bào vi khuẩn khả biến và vector biến nạp
Ớ Tế bào vi khuẩn khả biến: Tế bào vi khuẩn Ẹ coli chủng XL1-Blue (Stratagen) ựược sử dụng ựể chuẩn bị tế bào khả biến theo phương pháp của Inoue et al. (1990).
Ớ Kit dòng hóa: InsTAcloneỎ PCR Cloning Kit với vector pTZ57R/T
(hãng Fermentas).
http://www.fermentas.com
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 23