2.4.1. Nguyên tắc
Mẫu thực phẩm được acid hoá bằng acid phosphoric rồi đem cất, formol được giải phóng dưới dạng hoà tan trong dung dịch cất và được phát hiện bằng phản ứng lên màu với thuốc thử cromotropic.
2.4.2. Dụng cụ, thiết bị
- Cân kỹ thuật, cối, chày sứ 300ml
- Dụng cụ cất, bếp điện (hoặc đèn cồn), bình kjeldahl 500ml: 1 bộ - Bình định mức các loại: 1000, 100, 10ml
- Pipet các loại: 20, 10, 5, 1 ml, buret: 10 hoặc 25ml - Bình nón 100ml
- Ống nghiệm 12-15 ml, bông thuỷ tinh, phễu lọc
2.4.3. Hoá chất - thuốc thử (Merck)
- Acid cromotropic (1,8 - dihydroxy- naphthalen -3,6- disulfonic acid) - Acid phosphoric H3PO4 85%
- Acid sunfuric H2SO4 98% - Dung dịch Formol 30-34% - Dung dịch Iod chuẩn 0,1N - Dung dịch natrithiosulfat chuẩn 0,1N - Dung dịch natri hydroxyd 10%
- Dung dịch acid hydrocloric 35 – 37% - Giấy thử pH
- Silicon chống tạo bọt
2.4.4. Chuẩn bị thuốc thử và dung dịch chuẩn
- Pha dung dịch H2SO4 72%: Lấy 150 acid H2SO4 98%, cho từ từ vào cốc đã có 100ml nước, vừa cho vừa khuấy đều, ta được dung dịch H2SO4 72%.
- Pha dung dịch thuốc thử: Cân 0,5g acid cromotropic cho vào cốc 200ml đựng sẵn 100ml dung dịch H2SO4 72% khuấy mạnh cho acid cromotropic tan hết. Lọc qua phễu có bông thuỷ tinh, ta được thuốc thử có màu vàng rơm nhạt.
- Xác định nồng độ formol ban đầu: Lấy 2ml dung dịch formol 30-40% cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều (dung dịch A).
- Lấy một bình nón khác cho vào đó:
Dung dịch formol đã pha loãng trên (dung dịch A): lml
Nước cất: 5ml
Dung dịch Iod 0,1N: 10 ml
Nhỏ từ từ từng giọt dung dịch natri hydroxyd 10% đến khi có màu vàng nhạt. Đậy nút, để chỗ tối 10 phút. Sau đó cho thêm lml acid hydrocloric đậm đặc, cho thêm hồ tinh bột, chuẩn độ bằng Vml dung dịch natri thiosulfat 0,1N đến khi dung dịch mất màu xanh.
Vì 1ml Iod 0,1N tương đương 1,5 mg formol nên lượng formol trong 1 ml dung dịch A là: X = 1,5 (10 - V) mg. Do vậy, hàm lượng formol trong dung dịch A là X mg/ml (1000 X ppm).
Pha dung dịch formol nồng độ 10 ppm: Lấy 1 ml dung dịch A pha loãng với nước cất cho đủ 100 ml được dung dịch formol có nồng độ 10 X ppm (dung dịch B). Để có dung dịch formole 10 ppm, lấy dung dịch B pha loãng X lần.
dung dịch 75 ml formol có nồng độ 10 ppm.
2.4.5. Cách tiến hành
Chuẩn bi mẫu thử: Cân 100g mẫu cho vào cối sứ, thêm từ từ khoảng 50 ml nước cất và nghiền cho nhuyễn đều. Chuyển hỗn hợp vào bình kjeldahl có dung tích 500 ml. Tráng cối sứ, dụng cụ nghiền bằng 50 ml nước cất, cho dung dịch nước tráng này vào bình kjeldahl. Acid hoá bằng acid phosphoric 85% đến môi trường acid (thử bàng giấy quỳ, thấy chuyển sang màu đỏ), sau đó cho thêm 1 ml acid phosphoric và 0,5 ml silicon chống tạo bọt (do trong quá trình cất mẫu thử có hiện tượng hồ hoá, tạo bọt). Lắp hệ thống cất, cất lấy 50 ml dịch cất (dung dịch thử) trong khoảng 20-30 phút.
Với mẫu thực phẩm thể lỏng: Đong 200 ml thực phẩm, cho vào bình kjedahl, acid hoá hỗn hợp bằng H3PO4 đặc. Tiến hành như khi chuẩn bị mẫu thử ở thể rắn và bán rắn ở trên để có được 50 ml dịch cất.
Đinh tính formol trong mẫu thử (dich cất): Lấy 5 ml dung dịch thuốc thử cromotropic cho vào một ống nghiệm sạch. Thêm 1 ml dịch mẫu cất từ thực phẩm. Lắc đều ống nghiệm. Đặt ống nghiệm lên nồi cách thuỷ đang sôi trong 15 phút. Nếu có màu tím xuất hiện thì mẫu có formol. Nếu nồng độ formol trong mẫu càng cao thì màu càng tím. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,05 ppm khi làm phản ứng lên màu.
Phương pháp bán đinh lương formol trong mẫu thử (dịch cất)
Tiến hành phản ứng lên màu: Pha dãy màu chuẩn và song song tiến hành cùng
với mẫu thử nghiệm theo bảng 2.2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.2. Lấy 5 ống nghiệm đánh số thứ tự có thành phần nhƣ bảng sau
Số ống 1 2 3 4 5
Dung dịch thuốc thử (ml) 5 5 5 5 5
Dung dịch formol 10 ppm 0 1 2 5 0
Dung dịch cất từ thực phẩm (ml) 0 0 0 0 5
Tổng thể tích mỗi ống (ml) 10 10 10 10 10
Nồng độ formol trong ống (ppm) 0 1 2 5 Y
Lắc đều các ống, đem đun cách thuỷ sôi trong 15 phút, ta có được thang màu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện để so sánh màu:
Tiến hành so màu: So sánh màu của ống số 5 (mẫu thử) với các ống trong dãy màu chuẩn (số 1 - 4). Màu của ổng mẫu thử tương đương màu ống chuẩn nào thì nồng độ formol trong ống thử (Y ppm) bằng nồng độ formol trong ống chuẩn đó.
2.4.6. Tính kết qủa phân tích
- Nồng độ formol trong dịch cất từ thực phẩm = 2Y ( vì trong ống 5, dịch cất đã bị pha loãng gấp đôi, từ 5 thành 10 ml)
- Nồng độ formol trong thực phẩm rắn và bán rắn: Cppm = Y (vì 100g mẫu rắn ứng với 50 ml dịch cất). - Nồng độ formol trong thực phẩm lỏng:
Cppm = ½Y (vì 200 ml mẫu lỏng ứng với 50 ml dịch cất).
- Nếu nồng độ formol quá đặc thì phải pha loãng dịch cất từ thực phẩm để so sánh với dãy màu chuẩn.
- Lưu ý:
+ Phạm vi áp dụng: Không giới hạn các loại thực phẩm
+ Thận trọng khi thao tác với acid đậm đặc nhằm đảm bảo an toàn.
2.5. Phƣơng pháp định lƣợng formol [8] 2.5.1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này xác định dư lượng formol trong bún, phở, hủ tiếu và các thực
2.5.2. Tài liệu áp dụng
Định lượng formol trong bún, phở, hủ tiếu theo tiêu chuẩn ISO 14181-1
2.5.3. Nguyên tắc
Mẫu thực phẩm được acid hóa bằng acid H3PO4 85% rồi đem chưng cất. HCHO được giải phóng dưới dạng hòa tan trong dịch cất và được xác định bằng phản ứng lên màu với thuốc thử Acetylaceton (CH3COCH2COCH3)
O O O O O 2CH3 C H CH3 C C CH3 H+ CH3 C CH2 C CH2 + H C CH CH2 CH C C CH3 CH 3 C O CH 3 C C CH 3 C C O O O CH3 O CH3 Acetylaceton Phức màu vàng, = 410,6nm 2.5.4.Hoá chất (Merck)
- Acetylaceton (CH3COCH2COCH3) - Acid phosphoric H3PO4 85% - Acid acetic (CH3COOH)
- Dung dịch formol (HCHO) 30-40% - Chỉ thị phenolphtalein 0.5%
- Dung dịch Etanol (C2H5OH) 90° - Dung dịch chuẩn NaOH 0.1N - Dung dịch chuẩn H2C2O4 0.1N
- Dung dịch H2O2 3% trung tính : Lấy 10ml dung dịch H2O2 30% cho vào bình tam giác 100ml, thêm 2 giọt chỉ thị phenolphtalein. Chuẩn độ này bằng dung dịch NaOH 0.1N đến khi xuất hiện màu hồng, chuyển dung dịch này vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch .
2.5.5.Chuẩn bị dung dịch thuốc thử acetylaceton (Merck)
- Hòa tan 150g CH3COONH4 trong 800ml H2O, thêm tiếp 3ml acid acetic và 2ml acetylaceton rồi định mức thành 1 lít, dung dịch này được bảo quản trong chai nâu và ổn định sau 12 h. Chuẩn bị lại dung dịch mới sau 6 tuần, kể từ lúc pha. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.6.Chuẩn bị dung dịch chuẩn formol (Merck) 2.5.6.1. Xác đinh nồng độ formol ban đầu 2.5.6.1. Xác đinh nồng độ formol ban đầu
- Lấy lml dung dịch formol 30 - 40% cho vào bình định mức 500ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều (dung dịch A)
- Lấy 2 bình tam giác có nút mài:
+ Bình 1: Dung dịch formol đã pha loãng (dung dịch A) 10ml
Dung dịch NaOH 0.1N 10ml + Bình 2: Dung dịch formol đã pha loãng (dung dịch A) 10ml
Dung dịch NaOH 0.1N 10ml Dung dịch H2O2 3% trung tính 10ml
- Đậy kín nút 2 bình tam giác và lắc đều. Đun cách thủy ở 40°C trong 5 phút (lắc thật kỹ trong khi đun) làm lạnh nhanh, thêm tiếp vào mỗi bình 2 giọt chỉ thị phenolphtalein 0.5%, chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn H2C2O4 0.1N đến khi dung dịch mất màu hồng.
- Hàm lượng formol trong dung dịch A được tính theo công thức:
Co = Formol (mg/l) = (V1-V2) x 0.1 x 30.0264 x 1000/10 (2.1) + Trong đó: - V1: Thể tích dung dịch H2C2O4 0.1N dùng chuẩn độ bình 1
- V2: Thể tích dung dịch H2C2O4 0.1N dùng chuẩn độ bình 2 - 0.1: Nồng độ của dung dịch H2C2O4
- 30.0264 đương lượng gam của formol
2.5.6.2. Pha dung dich chuẩn formol 10ppm
100ml. Thêm nước cất đến vạch và lắc đều
X(ml) = 10x100/Co (2.2)
2.5.7. Cách tiến hành
2.5.7.1. Trƣờng hợp đối với mẫu bún tƣơi, phở tƣơi, hủ tiếu tƣơi
Cân chính xác khoảng 100g mẫu bún tươi, phở tươi, hủ tiếu tươi đã nghiền nhuyễn vào bình cầu 500ml, thêm tiếp 250ml nước cất. Acid hóa bằng H3PO4 85% đến môi trường acid (thử bằng giấy pH, thấy chuyển sang màu đỏ là được), sau đó thêm 1ml H3PO4 85% và lml chất chống tạo bọt (silicon). Lắp hệ thống cất, đun nóng. Quá trình chưng cất được kết thúc khi dung dịch cất thu được trong bình tam giác khoảng 40ml (làm lạnh dung dịch cất thu được để giảm mất chất phân tích). Chuyển phần dịch này vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều.
2.5.7.2.Trƣờng hợp đối với mẫu bún khô, phở khô, hủ tiếu khô
Cân chính xác khoảng 50g mẫu bún khô, phở khô, hủ tiếu khô đã nghiền nhỏ vào bình cầu 500ml, thêm tiếp 250ml nước cất. Acid hóa bằng H3PO4 85% đến môi trường acid (thử bằng giấy pH, thấy chuyển sang màu đỏ là được), sau đó thêm 1ml H3PO4 85% và lml chất chống tạo bọt (silicon). Lắp hệ thống cất, đun nóng. Quá trình chưng cất được kết thúc khi dung dịch cất thu được trong bình tam giác khoảng 40ml (làm lạnh dung dịch cất thu được để giảm mất chất phân tích). Chuyển phần dịch này vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều.
2.5.7.3. Định lƣợng formol trong mẫu thử (dịch cất)
Lấy 5ml dung dịch thuốc thử cho vào bình định mức 10ml, thêm 5ml dịch cất. Đậy kín nắp, đun cách thủy ở 40°C trong 30 phút. Nếu có màu vàng xuất hiện thì mẫu có formol. Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo bảng 2.3
Bảng 2.3. Xây dựng đƣờng chuẩn
Bình định mức 10 ml 1 0
.
3 4 5 6 7
Dung dịch thuôc thử ml 5 5 5 5 5 5 5
Dịch cất ml 0 0 0 0 0 0 5 Định mức đến vạch 10ml bằng nước cất, đậy nắp, lắc kỹ
Nồng độ Formol (ppm) 0 0.2 0.5 1 2 3 Cx
Đun cách thủy ở 40°C trong 30 phút, rồi làm lạnh, đem đo ở bước sóng 410.6nm.
2.5.8. Tính kết qủa phân tích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hàm lượng formaldehyde có trong mẫu tính theo công thức:
Formol (mg/kg) = Cx .10 .Vđm / Vx. m (2.3) + Trong đó: 10: Bình định mức 10 ml
Cx: Nồng độ formol tính từ đường chuẩn mg/1
Vđm: Thể tích định mức dịch cất Vx: Thể tích mẫu phân tích m: khối lượng mẫu (g)
Qui trình phân tích formol được thể hiện ở sơ đồ 2.2
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ qui trình phân tích formol trong bún, phở
Đồng nhất mẫu bún, phở, hủ tiếu
Đối với mẫu tươi + Cân 100g mẫu nghiền nhuyễn cho vào bình cầu 500ml
Đối với mẫu khô + Cân 50g mẫu nghiền nhỏ, cho vào bình cầu 500ml + 250ml nước cất + Axit hóa bằng H3PO4 + 1ml H3PO4 85% + 1ml chất chống tạo bọt + Lấy 5ml dung dịch cất được cho vào bình định mức 10ml. + 5ml dung dịch thuốc thử Acetylaceton, lắc đều. + Đun cách thủy 40oC, 30 phút + Đo ở bước sóng = 410,6 nm. (Phức có màu vàng) + Chưng cất mẫu (Qúa trình cất phải làm lạnh dịch thu được, giảm sự bay hơi chất phân tích)
+ Kết thúc quá trình cất, dịch cất thu được khoảng 40 ml, sau đó định mức
2.6. Mô hình thực nghiệm.
Mô hình thực nghiệm được thể hiện ở dưới sơ đồ 2.3
Sơ đồ 2.3. Sơ đồ mô hình thực nghiệm
2.7. Khảo sát khoảng tuyến tính [1]
Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, chúng tôi thực hiện chạy chuẩn hỗn hợp với dãy nồng độ từ 0 ppm; 0,2 ppm; 0.5 ppm; 1 ppm; 2 ppm; 3 ppm và lập đường chuẩn. Đường chuẩn là yếu tố quan trọng, quyết định sự đúng đắn của kết quả phân tích. Sau khi có được đường chuẩn, chúng tôi tiến hành thẩm định lại đường chuẩn thông qua việc đánh giá các thông số sau:
- Kiểm tra độ lệch của các điểm theo công thức Khảo sát khoảng
tuyến tính
Xây dựng phương
pháp Phân tích mẫu
Kiểm tra độ chụm
Kiểm tra độ đúng Tìm giá trị LOD, LOQ
Độ tái lặp Độ chụm trung
100 t c i c C C x C (2.4) i
: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn từ các điểm chuẩn Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn
Theo quy định nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, Châu Âu thì giá trị độ lệch của các điểm không được vượt quá 15%. Nếu điểm nào vượt thì chúng tôi tiến hành loại bỏ và thu hẹp lại dãy nồng độ này.
- Kiểm tra các hệ số trong phương trình hồi quy:
Phương trình hồi quy y = ax + b, trường hợp lý tưởng xảy ra khi b = 0. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên và luôn làm cho giá trị b khác không. Nếu giá trị b khác không có ý nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích của ta sẽ mắc sai số hệ thống. Để đánh giá các hệ số này, chúng tôi sử dụng phần mềm Excel và dựa vào chuẩn Student để đánh giá.
- Kiểm tra hệ số tương quan: Đường chuẩn phải có hệ số tương quan R ≥ 0,995 thì mới chấp nhận sử dụng.
2.8. Xác định độ nhạy của phƣơng pháp [1] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
▪ Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD)
- Nếu có mẫu trắng:
+ Tiến hành thực hiện theo quy trình xử lý 10 lần trên mẫu trắng không chứa chất cần phân tích. Sau đó đo trên máy quang phổ hấp thụ phân tử, đo lấy tín hiệu nền của mẫu (noise), lập cột trong phần mềm Excel tính độ lệch chuẩn (SD) của noise. Uớc lượng tín hiệu (signal) của chất cần phân tích là 3SD chính là giá trị LOD, LOD của phương pháp được tính dựa vào phương trình hồi quy.
+ Dùng dãy mẫu thêm chuẩn (Spike) với hàm lượng giảm dần chất cần phân tích.
- Từ dữ liệu LOD, tính LOQ theo công thức LOQ = 10*SD. (2.5)
▪ Nếu không có mẫu trắng: Sử dụng mẫu có chứa chất cần phân tích đã định
lượng trước nồng độ X’ (mg/l) pha loãng đến nồng độ X (mg/l) sao cho tín hiệu trên thiết bị đo khoảng hơn 10SD của nền mẫu (maxtric), LOD được tình theo công thức:
ois 3 . ( / ) n e signal H X LOD mg l H (2.6) Khi đo noise chỉ cần lấy tín hiệu xung quanh signal và không phải là những píc
của những chất khác có hàm lượng cao.
Giới hạn định lượng (LOQ): Từ các dữ liệu tính LOD, tính LOQ theo công thức là 10SD (nếu thực hiện trên mẫu trắng). Nếu trên nền mẫu có chất cần phân tích thì:
ois 10 . ( / ) n e signal H X LOQ mg l H (2.7) 2.9. Xác định độ chính xác của phƣơng pháp [12]
Độ chính xác là mức độ gần sát giữa các kết quả riêng rẽ xi với giá trị X thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ chính xác của phương pháp được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hay hệ số biến thiên (CV).
- Tính toán độ lệch chuẩn bằng phần mềm Excel với hàm STDEV.
2 1 i X X SD n (2.8) SD: Độ lệch chuẩn
Xi: Kết quả thu được trên mẫu thứ i X : Kết quả trung bình của 6 lần phân tích
RSD(%) CV(%) SD*100
X
(2.9) Đề cập đến độ chính xác của một phương pháp một cách chi tiết hơn, theo quan điểm mới nhất của tiêu chuẩn quốc tế (ISO 57251- 6:1994) và tiêu chuẩn quốc gia (TCVN 69101- 6:2005) thì:
Độ chính xác (accuracy) = độ chụm (precision) + độ đúng (trueness)
Độ chụm: Chỉ mức độ dao động của kết quả thử nghiệm quanh giá trị trung bình, độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên không liên quan đến giá trị thực. Độ chụm được phân ra thành 3 trường hợp
- Độ lặp lại
- Độ chụm trung gian - Độ tái lặp
2.9.1. Độ lặp lại của phƣơng pháp
Mẫu được phân tích 7 lần lặp lại (mỗi lần bắt đầu từ việc cân mẫu) bởi cùng một người, cùng một ngày, cùng một điều kiện máy móc dụng cụ và trong cùng một phòng thí nghiệm.
2.9.2. Độ chụm trung gian
Biểu thị độ chính xác của phương pháp theo các biến số của phòng thí nghiệm