Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU
2.3.2.Phương pháp nghiên cứu
+ Xác định tỷ lệ lợn nái mắc bệnh viêm tử cung bằng phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp công nhân tại trại, kết hợp với theo dõi trực tiếp.
2.3.2.1. Lấy mẫu dịch tử cung của lợn bình thường sau đẻ và lợn đang bị viêm tử cung.
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn xét nghiệm:
• Lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái bình thường sau đẻ 12-24h và lợn bị
viêm tử cung. Phân lập, giám định thành phần và số lượng vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng theo các phương pháp vi sinh vật thường quy.
• Làm kháng sinh đồ theo phương pháp của Kirby-Bauer (1996). • Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxoid (Anh) sản xuất.
• Đánh giá kết quả dựa theo tiêu chuẩn quốc tế 1996.
- Với lợn sau đẻ: dùng mỏ vịt (đã được sát trùng) mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm đã được vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5ml.
-Với lợn bị viêm, dùng mỏ vịt (đã được sát trùng) mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm đã được vô trùng, mỗi lần lấy khoảng 3-5ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu.
- Các mẫu thí nghiệm sau khi lấy được giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-80C trong vòng 24h đưa đến phòng thí nghiệm và tiến hành kiểm tra theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn học của tác giả (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978); (Phạm Kim Anh, Nguyễn Văn Quỳnh, 1991); (Nguyễn Văn Quỳnh, 1991).
- Để có thể đếm được số khuẩn lạc trên môi trường thạch thường, tùy theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha loãng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác định được độ pha loãng thích hợp với các bệnh phẩm như sau.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
+ Dịch tử cung lợn sau đẻ là: 10-4. + Dịch tử cung lợn viêm tử cung là: 10-7.
- Đếm tổng số khuẩn lạc trên một đĩa thạch và quy đổi trong 1ml dịch tử cung.
- Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào thạch đĩa. Mỗi mẫu xét nghiệm được đưa vào 2 đĩa thạch thường và đĩa thạch phân lập, mỗi đĩa thạch được cấy 0,1ml dịch và đánh số. Tất cả được bồi dưỡng trong tủấm 370C /24h. Sau đó đếm số khuẩn lạc có trong các đĩa ở môi trường thạch thường và thạch chuyên dụng. Số vi khuẩn trong 1ml dịch mẫu
được tính theo công thức. X=10.A.N
Trong đó X : số khuẩn lạc trong 1ml dung dịch. A : số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa.
N : độ pha loãng.
Đểđếm được tổng số các loại vi khuẩn có trong dịch nghiên cứu, trước tiên chúng tôi dùng môi trường thạch thường đểđếm tổng số các loại vi khuẩn có trong một đĩa thạch ở độ pha loãng thích hợp. Đồng thời chúng tôi còn sử
dụng các môi trường chuyên dụng sau để đếm các loại vi khuẩn có mặt chủ
yếu ở tử cung lợn khi bị viêm:
+ Môi trường Sapman dùng đểđếm vi khuẩn Staphylococcus.
+ Môi trường Edwards medium dùng đểđếm vi khuẩn Streptococcus. + Môi trường Brilliant greenagra dùng để đếm vi khuẩn E.coli và
Salmonella.
- Tổng số khuẩn lạc có trong 2 đĩa thạch trên phải nhỏ hơn hay bằng tổng số khuẩn lạc có trên đĩa thạch thường ở cùng một nồng độ pha loãng.
2.3.2.2. Phương pháp xác định số loại và số lượng vi khuẩn.
- Các đĩa thạch thường sau khi đã ria cấy vi khuẩn, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C/24h, lấy ra quan sát hình thái, kích thước và dạng khuẩn lạc. Từ đó sơ bộđịnh loại vi khuẩn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
- Mỗi loại vi khuẩn, khi mọc trên môi trường có thể sẽ hình thành một loại khuẩn lạc có kích thước, hình dáng và màu sắc riêng biệt như:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, rìa gọn, tròn, mặt lồi, láng bóng và có màu vàng rơm (nếu là Staphylococcusaureus).
+ Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc tròn trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể khuẩn lạc dạng R, khuẩn lạc tròn ướt, không trong suốt, màu tro, trắng nhạt hai đầu.
Sau khi xác định được các loại khuẩn lạc khác nhau, mỗi loại khuẩn lạc lại tiến hành phiết kính, nhuộm Gram để xem hình thái, tính chất bắt màu và cấu trúc đặc biệt của vi khuẩn như;
+ Staphylococcus: bắt màu (Gram +), hình cầu, tụ lại hình chùm nho. + Streptococcus: bắt màu (Gram +), có hình cầu hoặc hình trứng, đứng riêng lẻ hoặc chuỗi.
+ E.coli: bắt màu (Gram-), là trực khuẩn hình gậy ngắn 2 đầu tròn. + Salmonella: bắt màu (Gram -), là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai mầu tròn. Khuẩn lạc đã được tách thuần khiết, cấy vào các môi trường phân lập
để xác định tính chất mọc của chúng trong các môi trường này.
+ Môi trường Sapman : Staphylococcus khuẩn lạc to, rìa gọn. Nếu là tụ
cầu gây bệnh thì môi trường biến thành màu vàng, tụ cầu không gây bệnh thì môi trường giữ nguyên màu đỏ.
+ Môi trường Edwards medium: Streptococcus khuẩn lạc nhỏ, mặt hơi lồi, ướt mịn, rìa gọn.
+ Môi trường Brilliant green agra: E.coli làm môi trường biến màu vàng chanh. Salmonellalàm môi trường có màu đỏ.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32
- Cuối cùng cấy chuyển thạch máu giữ giống để giám định tiếp nếu có thể. Toàn bộ quy trình thí nghiệm xác định số lượng, số loại phân lập vi khuẩn có trong dịch tử cung lợn bình thường và bệnh lý rồi được kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh và thuốc hóa học trị liệu từ đó đưa ra phác đồđiều trị.
2.3.2.3. Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung lợn với các thuốc hóa học trị liệu bằng phương pháp làm kháng sinh đồ.
- Tiến hành làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán trên thạch của Kirby-Bauer.
- Phương pháp chỉ dùng canh trùng nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong 24 giờ, ria cấy trên mặt thạch. Để đĩa thạch từ 3-5 phút. Sau đó dùng panh vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh tiếp xúc với mặt thạch. Các mảnh giấy kháng sinh đặt cách nhau không dưới 24mm.
- Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch được khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm 370C, sau 16-18 giờ lấy ra đọc kết quả. Kết quả được đọc bằng cách dùng thước mm đểđo đường kính của vòng vô khuẩn, đo phía sau mặt đĩa thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn được tính ra mm. Nếu khuẩn lạc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
- Kết quả kháng sinh đồ chỉ được ứng dụng điều trị với vi khuẩn mẫn cảm với thuốc kháng sinh, còn khi vi khuẩn đã kháng thuốc tức vòng vô khuẩn dưới mức diệt khuẩn thì không được dùng.
- Khi vi khuẩn ở mức rất mẫn cảm chúng ta sử dụng thuốc ở liều điều trị trung bình khi vi khuẩn mẫn cảm ở mức trung bình thì điều trịđã chọn phải dùng ở liều cao hơn, hoặc bơm thẳng vào vị trí đang bị bệnh trong cơ thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33
2.3.2.4. Phương pháp xác định các đại lượng .
+ Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) = Tổng số con mắc X 100 Tổng số con theo dõi
+ Tỷ lệđộng dục lại (%) = Tổng số con động dục lại X 100 Tổng số con đã khỏi bệnh
2.3.2.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu lâm sàng.
Để xác định một số chỉ tiêu lâm sàng chính như: thân nhiệt, màu sắc, dịch viêm, mức độ thu nhận thức ăn chúng tôi đã sử dụng những phương pháp thường quy, đếm nhiều lần hoặc quan sát vào một thời điểm quy định và lấy số bình quân.
+ Thân nhiệt: dùng nhiệt kế thủy ngân đểđo ở trực tràng lợn, một ngày
đo 2 lần:
- Sáng 7- 9h - Chiều 16 - 18h
+ Màu sắc dịch viêm: theo dõi quan sát bằng mắt thường và ghi chép + Bỏăn: kiểm tra lượng thu nhận thức ăn và ghi chép