Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Lấy 5 mg bột nội nhũ (không có phần phôi) nghiền mịn cho vào ống 1.5 ml.
Thêm 35 µl dung dịch petrolium vào và trữ lạnh 1-2 giờ. Sau đó lấy ra phơi dưới gió khoảng 1h.
Thêm 30 µl dung dịch Albumin, để yên trong tủ lạnh khoảng 1-2 giờ. Ly tâm lạnh 14000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 2: Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuôn làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra Bảng tương quan giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Sambrook (1989).
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide.
Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều rồi cho vào bộ gel.
Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để 30-60 phút gel sẽ đông. Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide.
Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
20
Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước. Để 30-60 phút gel sẽ đông, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.8 Công thức pha dung dịch tạo gel (Sambrook, 1989)
Hóa chất (1gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất 30% Acrylamide 1,5M Tris H (pH= 8,8) 1M Tris HCl (pH=6,8) 10% SDS 10% Amonium persulfate TEMED 1,6 2 1,3 - 0,1 0,05 0,002 0,68 0,17 - 0,13 0,04 0,01 0,001
Bước 3: Tiến hành điện di
Bơm 10µl dung dịch ly trích mẫu/giếng.
Chạy điện di với hiệu điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách. Bước 4: Nhuộm và rửa gel
Gel được nhuộm trong hai giờ bằng dung dịch nhuộm Coomassie 0,2% Brilliant Blue R250;
Rửa gel trong dung dịch acid acetic:methanol:nước theo tỷ lệ 20:05:75, hoặc rửa trong microwave trong 30 phút.
Bước 5: Đọc kết quả, scan và bảo quản gel.
Bước 6: Uớc lượng trọng lượng Protein (polypectide)
Dùng thước đo chiều dài di chuyển của thuốc nhuộm và chiều dài di chuyển của Protein (polypeptide), tính giá trị Rf.
Rf=khoảng cách di chuyển của Protein (polypeptide)/ khoảng cách di chuyển của thuốc nhuộm
Đổi giá trị chiều dài di chuyển của Protein (polypeptide) chuẩn, chuyển trọng lượng sang dạng logarith và xác định khối lượng phân tử Protein (polypeptide) cần biết.
21
2.3.5 Phương pháp nhuộm bạc
Bước 1: Cố định gel trong dung dịch (30ml ethanol 95% + 10ml acid acetic + 60ml nước cất) lắc trong 1 giờ.
Bước 2: Ủ gel trong dung dịch ethanol 30% lắc trong 30 phút. Bước 3: Tiếp tục ủ trong ethanol 30% trong 30 phút
Bước 4: Loại bỏ ethanol, ủ gel trong nước cất trong 10 phút (lặp lại 2 lần).
Bước 5: Ủ gel trong AgNO3 0,1% (0,1g AgNO3+100ml nước cất) trong 30 phút.
Bước 6: Loại bỏa AgNO3 rữa lại với 2 lần nước.
Bước 7: Pha chất phản ứng (2,5g sodium carbonat+0,1ml formondehit + 100ml nước cất). Lăc gel trong dung dịch chất phản ứng cho đến khi xuất hiện băng chỉ thị.
Bước 8: Bỏ chất phản ứng và ủ gel trong chất ngưng phản ứng (1ml acid acetic + 100ml nước cất)
22
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN