Bước 1: Trồng cây F6 thu hạt F7 thử thơm bằng cảm quan
Bước 2: Chọn các dòng thơm từ hạt F7 tiếp tục nhân lên, theo dõi, đánh giá các chỉ tiêu nông học.
Bước 3: Thu hạt F8, đánh giá phẩm chất hạt gạo, phân tích mùi thơm, chọn lọc các dòng thơm.
13
Bước 4: Phân tích phẩm chất hạt gạo của những dòng được chọn như nhiệt trở hồ, độ bền thể gel, hàm lượng amylose, hàm lượng protein.
Bước 5: Điện di protei Albumin, đánh giá khả năng chịu mặn.
2.3.2 Phương pháp đánh giá phẩm chất gạo
* Hàm lượng Amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang và Rodriguez (1980). Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
Ethanol 95% HCl 30% NaOH 1 N
Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI) Bước 2: Chuẩn bị mẫu
Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
Thêm 9,5 ml NaOH 1 N, đun sôi trong 10 phút và lắc đều. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).
Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều. Thêm 250 μl HCl 30%, lắc đều.
Thêm 250 μl dung dịch Iod, lắc đều. Thêm nước cất đến vạch định mức.
Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
Lắc đều trước khi cho vào cuvette và đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b Trong đó: Y là độ hấp thụ OD X là lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml).
14
Tính hàm lượng amylose theo công thức: 100
2 (%) X
Amylose
Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở (Bảng 2.3).
Bảng 2.1 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose (IRRI, 1988)
Phân nhóm Hàm lượng amylose (%)
Gạo nếp 0-2 Gạo tẻ Rất thấp 3-9 Thấp 10-19 Trung bình 20-25 Cao > 25 * Hàm lượng protein
Tiến hành theo phương pháp Lowry O.H (1951) Bước 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
Dung dịch NaOH 0,1 N.
Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N). Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
Dung dịch C (A:B = 45 :5). Dung dịch Folin 1 N
Bước 2: Chuẩn bị mẫu
Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1 N. Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm.
Bước 3: Pha loãng mẫu và đo
Vortex mẫu sau đó ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
Hút 100 μl mẫu cho vào ống 10 ml. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 μl NaOH 0,1 N.
Thêm 1 ml nước cất, lắc đều. Thêm 500 μl dung dịch C.
15
Trộn đều và để yên trong 10 phút.
Thêm 50 μl Folin 1 N, trộn đều và để yên trong 30 phút.
Lắc đều mẫu, sau đó cho vào Cuvette và đo ở bước sóng 580 nm. Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). Đường chuẩn có dạng:
Y = aX + b
Trong đó: Y là Độ hấp thụ OD.
X là Lượng protein có trong mẫu đem đo.
Hàm lượng protein được tính theo công thức: (%) 100
m X P
Với: m là trọng lượng thực của mẫu:
14 100 %) 100 ( 10 H m H%: Độ ẩm của mẫu * Độ bền thể gel
Theo phương pháp của Tang et al. (1991). Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Tách vỏ trấu và đo ẩm độ hạt gạo.
Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12 %). Bước 2: Hoà tan mẫu
Thêm 0,2 ml ethanol 95 % có chứa 0,025 % thymol blue. Thêm 2 ml KOH 0,2 N. Sau đó khuấy đều bằng máy Vortex. Đậy nắp và đun cách thủy (nhiệt độ 100oC) khoảng 5 phút.
Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong nồi nước đá 10 phút. Bước 3: Đọc và ghi kết quả
Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt bằng phẳng, để gel chảy từ từ và sau một giờ thì tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí trên của thể gel).
Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) như được trình bày ở Bảng 2.4.
16
Bảng 2.2 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Phân cấp Chiều dài thể gel (mm) Đặc tính
1 80 – 100 Rất mềm 3 61 – 80 Mềm 5 41 – 60 Trung bình 7 35 – 40 Cứng 9 < 35 Rất cứng *Nhiệt trở hồ
Tiến hành theo phương pháp của Jenings et al. (1979).
Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt và để vào dĩa petri.
Thêm 10 ml KOH 1,7 % vào mỗi dĩa petri.
Đậy dĩa petri lại và để yên trong 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của Jenings et al. (1979) được trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 2.3 Bảng phân cấp độ trở hồ (Jenings et al., 1979)
Phân cấp Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên.
2 Hạt gạo phòng lên.
3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay rõ nét.
4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng.
5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa chung với viền.
7 Hạt tan hoàn toàn và quyện vào nhau.
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức:
N n x Captroho i Trong đó: xi : cấp độ trở hồ; n: số hạt có cấp độ trở hồ xi; N: số hạt thử nghiệm
17
Đánh giá cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của Jenings et al.
(1979) theo Bảng 2.6.
Bảng 2.4 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của Jenings et al. (1979)
Phân cấp Độ trở hồ 1-3 4-5 6-7 Cao Trung bình Thấp
* Trắc nghiệm tính thơm bằng cảm quan
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Lấy 30 hạt gạo cho vào ống nghiệm 15 ml.
Bơm vào mỗi ống nghiệm 5 ml nước cất, đậy kín ống nghiệm bằng giấy bạc.
Bước 2: Nấu và ngửi mùi
Mang ống nghiệm nấu trong Waterbath ở 100oC trong 15 phút. Sau đó đem ra ngửi mùi (5 đến 6 người thực hiện)
So sánh kết quả và cho kết luận sau cùng.
Bảng 2.5 Phân cấp mùi thơm theo thang đánh giá của IRRI (1996)
Phân cấp Đánh giá
0 Không thơm
1 Thơm nhẹ
2 Thơm
* Phương pháp phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo
Đo chiều dài hạt gạo dùng giấy kẻ li hay thước đo, mỗi dòng lấy 10 hạt gạo xếp theo chiều dọc và chiều ngang.
Tiến hành đo 3 lần và lấy trung bình.
18
Bảng 2.6 Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo theo IRRI (Juliano, 1993)
2.3.3 Phương pháp thanh lọc khả năng chịu mặn
Bước 1: Hạt giống thử nghiệm phải được xử lý nhiệt trong 5 ngày trong
tủ sấy ở 50oC để phá vở miên trạng của hạt giống. Sau khi phá vở miên trạng, khử trùng hạt giống với thuốc diệt nấm và rửa sạch với nước cất. Đặt hạt tiệt trùng trong đĩa petri với giấy lọc ẩm và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ để lúa nảy mầm.
Bước 2: Gieo hai hạt nảy mầm ở mỗi lỗ trên tấm xốp (mười lỗ tương ứng
20 hạt/giống/dòng. Trong ba ngày đầu chỉ để cây con trên khay xốp chứa đầy nước. Lưu ý: Giữ cây con nguyên vẹn, hạn chế tác động đến cây con.
Bước 3: Sau 3 ngày, khi cây con phát triển tốt, thay thế nước bằng dung
dịch dinh dưỡng Yoshida đã thêm muối theo đúng yêu cầu của nồng độ 8‰ và 10‰. Lưu ý: Hàng ngày kiểm tra mực nước, thêm nước cất đúng 3 lít vào các khay mặn.
Bước 4: Đối với dung dịch thử mặn sau mỗi 8 ngày thay vào dung dịch
muối mới có độ mặn tương ứng. Đánh giá khả năng chịu mặn:
Thường xuyên theo dõi thí nghiệm, đến khi giống chuẩn nhiễm IR28 chết hoàn toàn (cấp 9).
Đánh giá sự chống chịu mặn của cây mạ bằng thang đánh giá của IRRI (1997).
Cấp Chiều dài hạt gạo (mm) Dạng hạt (mm)
1 Rất dài > 7,50 Thon dài (D/R >3)
3 Dài 6,61 -7,50 Trung bình (D/R = 2,1-3)
5 Trung bình 5,51 -6,60 Bầu (D/R = 1,1-2)
19
Bảng 2.7 Tiêu chuẩn đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển (IRRI, 1997)
Cấp Mô tả triệu chứng Đánh giá
1 Tăng trưởng bình thường, không có vết cháy Chống chịu tốt
3 Gần như bình thường, nhưng đầu lá hoặc vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại
Chống chịu
5 Tăng trưởng chậm, hết lá khô, một vài chồi bị chết
Chống chịu trung bình
7 Tăng trưởng bị ngưng lại hoàn toàn, hầu hết lá bị khô, một vài cây bị chết
Nhiễm
9 Tất cả cây bị chết khô Rất nhiễm
2.3.4 Phương pháp điện di protein thành phần (Albumin)
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Lấy 5 mg bột nội nhũ (không có phần phôi) nghiền mịn cho vào ống 1.5 ml.
Thêm 35 µl dung dịch petrolium vào và trữ lạnh 1-2 giờ. Sau đó lấy ra phơi dưới gió khoảng 1h.
Thêm 30 µl dung dịch Albumin, để yên trong tủ lạnh khoảng 1-2 giờ. Ly tâm lạnh 14000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 2: Làm gel
Tùy theo chiều dài, rộng và độ dày của khuôn làm gel mà thể tích mỗi gel thay đổi. Sau khi tính được thể tích và phần trăm gel cần có, tra Bảng tương quan giữa lượng và phần gel để xác định thành phần các dung dịch.
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide và gel cô mẫu 5% Polyacrylamide theo quy trình của Sambrook (1989).
Làm gel phân tách 12% Polyacrylamide.
Lắp kính bộ gel, trộn dung dịch A, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều rồi cho vào bộ gel.
Thêm 2 giọt nước trên bề mặt dung dịch gel, để 30-60 phút gel sẽ đông. Làm gel cô mẫu 5% Polyacrylamide.
Loại bỏ lớp nước trên bề mặt gel phân tách, trộn dung dịch B, C + nước trong cốc nhỏ, thêm AP, TEMED và khuấy đều, cho vào bộ gel.
20
Cài răng lược giữa hai tấm kính của gel để tạo giếng, thêm một giọt nước. Để 30-60 phút gel sẽ đông, loại bỏ răng lược, lắp vào khung điện di, cho dung dịch điện di vào ngập các giếng gel.
Bảng 2.8 Công thức pha dung dịch tạo gel (Sambrook, 1989)
Hóa chất (1gel) Gel phân tách 12% (ml) Gel cô mẫu 5% (ml)
Nước cất 30% Acrylamide 1,5M Tris H (pH= 8,8) 1M Tris HCl (pH=6,8) 10% SDS 10% Amonium persulfate TEMED 1,6 2 1,3 - 0,1 0,05 0,002 0,68 0,17 - 0,13 0,04 0,01 0,001
Bước 3: Tiến hành điện di
Bơm 10µl dung dịch ly trích mẫu/giếng.
Chạy điện di với hiệu điện thế 20V ở gel cô mẫu và 40V ở gel phân tách. Bước 4: Nhuộm và rửa gel
Gel được nhuộm trong hai giờ bằng dung dịch nhuộm Coomassie 0,2% Brilliant Blue R250;
Rửa gel trong dung dịch acid acetic:methanol:nước theo tỷ lệ 20:05:75, hoặc rửa trong microwave trong 30 phút.
Bước 5: Đọc kết quả, scan và bảo quản gel.
Bước 6: Uớc lượng trọng lượng Protein (polypectide)
Dùng thước đo chiều dài di chuyển của thuốc nhuộm và chiều dài di chuyển của Protein (polypeptide), tính giá trị Rf.
Rf=khoảng cách di chuyển của Protein (polypeptide)/ khoảng cách di chuyển của thuốc nhuộm
Đổi giá trị chiều dài di chuyển của Protein (polypeptide) chuẩn, chuyển trọng lượng sang dạng logarith và xác định khối lượng phân tử Protein (polypeptide) cần biết.
21
2.3.5 Phương pháp nhuộm bạc
Bước 1: Cố định gel trong dung dịch (30ml ethanol 95% + 10ml acid acetic + 60ml nước cất) lắc trong 1 giờ.
Bước 2: Ủ gel trong dung dịch ethanol 30% lắc trong 30 phút. Bước 3: Tiếp tục ủ trong ethanol 30% trong 30 phút
Bước 4: Loại bỏ ethanol, ủ gel trong nước cất trong 10 phút (lặp lại 2 lần).
Bước 5: Ủ gel trong AgNO3 0,1% (0,1g AgNO3+100ml nước cất) trong 30 phút.
Bước 6: Loại bỏa AgNO3 rữa lại với 2 lần nước.
Bước 7: Pha chất phản ứng (2,5g sodium carbonat+0,1ml formondehit + 100ml nước cất). Lăc gel trong dung dịch chất phản ứng cho đến khi xuất hiện băng chỉ thị.
Bước 8: Bỏ chất phản ứng và ủ gel trong chất ngưng phản ứng (1ml acid acetic + 100ml nước cất)
22
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 Thế hệ F6 (vụ 1)
Các hạt F6 của 2 THL 13-01-01-05-04 và THL 13-08-02-02-01 được chọn thông qua điện di protein tổng số được trồng riêng trong từng lô thí nghiệm trong nhà lưới. Tương tự như ở các thế hệ trước, các dòng cây F6 cũng được tuyển chọn theo hướng có đặc tính nông học tốt: ngắn ngày, thấp cây, khả năng nở bụi cao,… để tìm ra dòng có phẩm chất tốt. Ở thế hệ này, ta tiến hành kiểm tra tính thơm của các dòng sau thu hoạch.
3.1.1 Một số chỉ tiêu nông học của cây F6
Bảng 3.1 Thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, chiều dài bông của cá thể cây F6
Thời gian sinh trưởng
Theo Bảng 3.1 hầu hết các cá thể có thời gian sinh trưởng dao động từ 98-105 ngày. Cá thể có thời gian sinh trưởng ngắn nhất là THL 13-01-01-05- 04-1 (98 ngày) và cá thể có thời gian sinh trưởng dài nhất là THL 13-08-02- 02-01-1 (105 ngày). Có thể thấy thời gian sinh trưởng của các cá thể còn nhiều biến động, điều này cũng phản ánh độ thuần chưa cao ở thế hệ này. Theo bảng phân loại cây lúa dựa vào thời gian sinh trưởng (Nguyễn Thành Hối, 2007) thì các cá thể của THL OM5629xTP6 thuộc nhóm ngắn ngày (A1: TGST 90-105 ngày). Theo đó, năng suất sẽ bị hạn chế hơn các giống dài ngày khác. Tuy
Tên cá thể TGST (Ngày) Cao cây (cm) Dài bông (cm) THL 13-01-01-05-04-1 98 93 24,1 THL 13-01-01-05-04-2 100 98 23 THL 13-01-01-05-04-3 104 98 21,7 THL 13-08-02-02-01-1 THL 13-08-02-02-01-2 THL 13-08-02-02-01-3 105 104 102 95 92 92 25,8 27 27,5
23
nhiên, vì còn có điều kiện ngoại cảnh tác động nên chưa thể có kết luận nhiều về năng suất của THL ở thế hệ này.
Chiều cao cây
Chiều cao của 6 cá thể biến thiên trong khoảng 92-98 cm. Khoảng biến thiên tương đối ngắn cho thấy sự khác biệt về chiều cao là không đáng kể. Theo Akita (1989), cây lúa cao từ 90-100 cm được coi là lý tưởng về năng suất. Do đó các cá thể ở thế hệ này có chiều cao tương đối thấp nằm trong khoảng lý tưởng về năng suất và cũng phù hợp với điều kiện đồng ruộng Việt Nam là chiều cao cây từ 80-110 cm, theo Võ Tòng Xuân (1986)
Chiều dài bông
Chiều dài bông của các cá thể biến động không đáng kể, dao động từ 21,7-27,5 cm. Chiều dài bông các cá thể đều dài, điều này rất có ý nghĩa trong công tác chọn giống lúa có năng suất cao.
3.1.2 Đánh giá mùi thơm bằng cảm quan
Bảng 3.2 Kết quả trắc nghiệm mùi thơm bằng cảm quan của 6 dòng ở thế hệ F6
STT Dòng Thơm Thơm nhẹ Không thơm
1 THL 13-01-01-05-04-1 2 4 _ 2 THL 13-01-01-05-04-2 _ 1 5 3 THL 13-01-01-05-04-3 _ _ 6 4 THL 13-08-02-02-01-1 _ _ 6 5 THL 13-08-02-02-01-2 1 5 _ 6 7 8 THL 13-08-02-02-01-3 OM5629 TP6 _ _ 6 _ _ _ 6 6 _
Kết quả đánh giá tính thơm cho thấy giống đối chứng OM5629 (cây mẹ) không thơm và TP6 (cây cha) thơm. Trong 6 dòng con lai thì có 2 dòng được đánh giá là thơm nhẹ là THL 13-01-01-05-04-1 và THL 13-08-02-02-01-2. Các ý kiến đánh giá chỉ giống nhau ở mức tương đối vì đây là phương pháp mang tính chất cảm quan nên chỉ phản ánh phần nào đặc tính thơm của giống lúa. Mùi thơm phụ thuộc vào cảm giác của từng người, đồng thời khả năng lan truyền nhanh mùi thơm trong không khí (hợp chất 2-acetyl-1-pyrroline) cũng dẫn đến kết quả không chính xác. Tuy nhiên, kết quả sơ bộ được chọn dựa theo số đông những người có kinh nghiệm nên phản ánh được độ tin cậy của phương pháp này.
24
3.2 Thế hệ F7 (vụ 2)
Các cá thể cây F7 được chọn và nhân lên từ các hạt F7 của 2 dòng có mùi thơm nhẹ từ thế hệ F6. Ở thế hệ này, ngoài việc tuyển chọn các cá thể có đặc tính nông học tốt, mùi thơm, còn tiến hành phân tích các thành phần năng suất và tiến hành thử mặn.