Nhằm mục đích quy tụ gen chịu ngập vào giống AS996 giống có chất lƣợng cao, phẩm chất tốt. Tiến hành lai giữa AS996 x IR64Sub1 và chọn lọc các cá thể mang gen ở các thế hệ nhờ chỉ thị phân tử SSR.
Thế hệ F1 lai tạo đƣợc 22 cá thể. Các cá thể này đƣợc trồng, tách chiết ADN để xác định cây lai nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử.
Để xác định các cá thể F1 mang gen kháng, tiến hành phản ứng PCR với AND của mẹ (AS996) và bố (IR64Sub1) và các con lai F1 với hai chỉ thị cho đa hình liên kết chặt với gen Sub1 là SC3, ART5. Kết quả kiểm tra xác định cá thể mang gen đƣợc minh họa ở hình 10.
Trong tổng số 22 cá thể F1 đƣợc đánh số từ 1-22 tƣơng ứng từ giếng số 3 đến giếng số 24, ghi nhận có 11 mẫu ADN của 11 cá thể có mang 2 băng: 1 băng đặc trƣng cho AS996, một băng đặc trƣng cho IR64Sub1 là các cá thể số: 4, 5, 6, 7, 9, 16, 17, 19, 20, 21, 22. Các cá thể này đƣợc chọn làm mẹ để tiến hành lai trở lại với giống nhận gen tạo thế hệ BC1F1. Điều này cho thấy một nửa số hạt đã tự thụ trƣớc khi tiến hành khử đực. Dựa trên kết quả này, chỉ sử dụng những cá thể lai có chỉ thị liên kết gen để lai tạo quần thể BC1F1.
3.3.2. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC1F1
Dựa trên bản đồ vùng QTL chịu ngập thì chỉ thị tốt nhất trong khu vực Sub1 là ART5 đƣợc thiết kế từ vùng promoter của gen và SC3 đƣợc thiết kế ở phía dƣới của gen Sub1 trên NST số 9 đƣợc sử dụng để lựa chọn những cá thể mang gen. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành giữa ADN các giống lúa AS996, IR64Sub1 và các con lai với hai chỉ thị trên.
Tổng số 497 cá thể của quần thể BC1F1 đƣợc tiến hành tách chiết ADN và kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 11 và 12.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Hình 10. Kiểm tra cá thể mang gen kháng ở thế hệ F1 với chỉ thị SC3
Kết quả trên hình 11 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 49 và giống cho gen ở giếng số 50 là các giếng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 18, 23, 25, 27, 29, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 48.
Giếng số 5, 11, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 24, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 41, 46, 47 chỉ mang băng của giống nhận gen, những cá thể này không mang gen kháng đƣợc loại bỏ ở các bƣớc sàng lọc sau.
Kết quả trên hình 12 thể hiện khi phân tích các cá thể BC1F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen ở giếng số 2 và giống cho gen ở giếng số 3 là các giếng số 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24,26, 27, 33, 34, 39, 45, 47, 48.
Các giếng còn lại chỉ mang băng của giống nhận gen (AS996).
Hình 11. Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3. Giếng 1, 26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC1F1
Giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1
Hình 12. Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5.Giếng 1, 50: 25bp ladder, giếng 2:AS996, giếng 3:IR64Sub1, 4-49: các cá thể BC1F1
Từ kết quả phân tích, những cá thể mang 2 băng chỉ thị của cả giống cho gen và giống nhận gen sẽ đƣợc lựa chọn cho lai tạo thế hệ lai sau đó.
Kết quả thu đƣợc 165 cá thể BC1F1 dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3. Những cá thể dị hợp tử mang cả hai băng của giống nhận gen và giống cho gen với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 đƣợc lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp. Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ 165 cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng 10 chỉ thị cho đa hình trên nhiễm sắc thể số 9 (minh họa ở bảng 9).
Bảng 9. Các chỉ thị trên NST số 9 và vị trí tƣơng ứng Tt Tên chỉ thị trên NST số 9 Vị trí (Mb) 1 RM23662 0,4 2 RM 316 1,0 3 R9M10 4,5 4 ART5 6,3 5 SC3 6,6 6 RM24013 9,4 7 RM296 10,7 8 RM 105 12,5 9 R9M30 14,6 10 RM 7175 16,8 11 RM257 17,7 12 RM215 20,9
Kết quả phân tích để sàng lọc cá thể tái tổ hợp trên NST 9 đƣợc minh họa từ hình 13 đến hình 15.
Hình 13. Sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thịRM23662
Giếng 1,26: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: các cá thể BC1F1 giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1
Sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM23662 ở hình 13 cho thấy cá thể tái
tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 44 và giếng số 46.
Sàng lọc các cá thể BC1F1với chỉ thị RM240113 ở hình 14cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 14, 27, 34, và giếng số 46.
Tƣơng tự sàng lọc các cá thể BC1F1 với chỉ thị RM7175 ở hình 15 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 2, 6, 10, 11, 14, 15, 16, 18, 20, 24, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 40, 42 và giếng số 46.
Sử dụng 10 chỉ thị lựa chọn đƣợc tổng số 14 cá thể tái tổ hợp, trong đó 5/14 cá thể tái tổ hợp mang trao đổi chéo tại vị trí của R9M10 và RM24013; 9/14 cá thể tái tổ hợp tại 1 đầu của NST tại vị trí của RM24013. Kết quả này đã xác định đƣợc đoạn trao đổi chéo mang gen Sub1 ở cả hai đầu trên và dƣới của gen Sub1 đã đƣợc chuyển vào các dòng BC1F1. Kết quả 14 cá thể tái tổ hợp đƣợc lựa chọn để tìm cá
1 2 26 A IR 51
Hình 15. Sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM7175
Giếng 1,26 51: 25bp ladder, 2-25 và 27-48: cá thể BC1F1,giếng 49:AS996, giếng 50: IR64Sub1
Hình 14. Sàng lọc các cá thể BC1F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM24013
thể mang nền di truyền cây mẹ lớn nhất là các cá thể số 5, 6, 39, 62, 63, 103, 153, 166, 215, 327, 340, 412, 422, 428.
Đối với thế hệ BC1F1, tổng số 26 chỉ thị cho đa hình không liên kết với gen
Sub1 trên 11 nhiễm sắc thể còn lại để lựa chọn nền di truyền của cây nhận gen. Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn. Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ đƣợc lựa chọn để lai tạo thế hệ BC2F1. Kết quả đƣợc nêu ở bảng 10, hình 16, và hình 17.
Bảng 10. Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 14 cá thể BC1F1 tái tổ hợp
Cây số 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428 A 66.67 54.17 62.50 41.67 54.17 45.83 58.33 45.83 66.67 58.33 66.67 72.00 75.00 72.00 H 25.00 45.83 37.50 58.33 45.83 33.33 41.67 54.17 33.33 41.67 33.33 24.00 25.00 24.00 R% 79.17 77.08 81.25 70.83 77.08 62.50 79.17 72.92 83.33 79.17 83.33 84.00 87.50 84.00 0 cM RM23759 0.0 R9M10 1.0 RM105 2.0 ART5 3.0 SC3 4.0 RM23662 5.0 RM24013 6.0 RM296 7.0 RM7175 8.0 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428 L e g e n d A B H Group 1 [chrom9] 0 cM R4M13 0.0 R4M17 1.0 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428 L e g e n d A B H Group 5 [chrom4] 0 RM19840 0.0 SO6061 1.0 SO6065A 2.0 5 6 39 62 63 103 153 166 215 327 340 412 422 428 L e g e n d A B H
Từ kết quả trên cho thấy 14 cá thể tái tổ hợp có mang gen Sub1 và chứa tối đa nền gen của giống nhận gen từ 62,5% đến 87,5%. Các cá thể có nền di truyền cao nhất là P422 với 87,5% ngoài ra còn có các cá thể P412 (84%) P428 (84%), P215 (83,33) và P39 (81,25). 0 cM ch rom 9 RM23759 0.00 R9M10 1.00 RM105 2.00 ART5 3.00 SC3 4.00 RM23662 5.00 RM24013 6.00 RM296 7.00 RM7175 8.00 ch rom 1 SO1132A 0.00 ch rom 2 RM109 0.00 RM154 1.00 ch rom 3 RM3867 0.00 ch rom 4 R4M13 0.00 R4M17 1.00 ch rom 5 R5M20 0.00 RM18877 1.00 chro m 6 RM19840 0.00 SO6061 1.00 SO6065A 2.00 ch rom 7 SO7053 0.00 RM18 1.00 ch rom 8 RM149 0.00 ch rom 11 RM206 0.00 S11117C 1.00 ch rom 12 RM17 0.00 Lege nd A B H Ind no:13 [422] -
Hình 17. Biểu đồ 11 NST của cá thể P422 thế hệ BC1F1 quần thể AS996/IR64 Sub1
Kết quả đã lựa chọn đƣợc 5 cá thể BC1F1 có mang vùng gen Sub1 và chứa tối đa nền gen của giống nhận gen (R%) trong khoảng từ 80 - 86% để tiếp tục lai tạo thế hệ BC2F1. Gen Sub1 là một trong những gen chính quy định tới 70% tính chống chịu ngập chìm trong hầu hết các giống lúa đã đƣợc các nhà khoa học IRRI thử nghiệm từ trƣớc tới nay.
Kết quả trên có thể đƣợc lý giải theo nhƣ công thức (Bert Collard và David Mackill)[37]với n là số hế thệ hồi giao, là tỷ lệ kiểu gen của cây nhận gen có trong các thế hệ con lai BCnF1. Số lần hồi giao càng nhiều thì tỷ lệ này càng cao. Sự tƣơng quan này đƣợc thể hiện trong Bảng 11.
Bảng 11. Sự tƣơng quan giữa số thể hệ với tỷ lệ kiểu gen của giống nhận gen đƣợc chuyển vào con lai BCnF1
Số thế hệ hồi giao (n) Tỷ lệ 1 0,75 2 0,875 3 0,938 4 0,969 5 0,984
Theo nhƣ công thức trên thì thế hệ BC1F1 cá thể mang nền gen cây nhận gen trung bình đạt 75%. Tuy nhiên, điều này không có nghĩa tất cả các cá thể BC1F1 đều chứa 75% nền gen cây nhận gen. Đa số các cá thể chứa từ 68-82% nền gen cây nhận gen. Có khoảng 1% số cá thể chứa ≥ 86% nền gen cây nhận Frisch (1999)[42]. Sử dụng công nghệ chỉ thị phân tử cho phép chọn ra 1% số cá thể BC1F1 vừa mang gen của giống cho gen, vừa mang 86% trở lên nền gen của cây nhận gen. Tiếp theo, ở thế hệ BC2F1, bằng công nghệ chỉ thị phân tử, có thể phát hiện ra một số cá thể vừa mang gen của giống cho gen, vừa mang 98% trở lên nền gen của cây nhận gen. Nhƣ vậy, quy trình chọn giống bằng phép lai hồi giao với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể kết thúc ở ngay thế hệ BC3, khi chọn ra đƣợc cá thể vừa mang gen của giống cho gen, vừa mang gần 100% nền gen của cây nhận gen.
3.3.3. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC2F1
Từ 5 cá thể BC1F1 đƣợc lựa chọn đã lai tạo đƣợc quần thể thế hệ BC2F1 với 506 cá thể. Tiến hành tách chiết ADN, làm phản ứng PCR với các bƣớc nhƣ ở thế hệ BC1F1. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 18 và hình 19.
Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống cho gen và giống nhận gen là giếng số 4, 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 22, 25, 27, 29, 31, 35, 36, 39.
Những giếng còn lại các cá thể chỉ cho 1 băng của giống nhận gen là AS996 những cá thể này không mang gen Sub1.
Hình 18. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3
Khi phân tích các cá thể BC2F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống là giếng số 3, 5, 10, 16, 18, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 47, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 60, 61.
Những giếng còn lại mang băng của AS996.
Sau bƣớc sàng lọc gen đích với hai chỉ thị ART5 và SC3 để kiểm tra sự có mặt của gen đích Sub1 trong các cá thể con lai thu đƣợc 245 cá thể dị hợp tử mang hai băng của cả giống cho và nhận gen.
Sau đó,Tiến hành chọn lọc các cá thể tái tổ hợp bằng 10 chỉ thị kề hai bên gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9 đƣợc nêu ở bảng 8 với 245 cá thể mang gen. Kết quả đƣợc minh họa từ hình 20 đến hình 22.
Sàng lọc các cá thể BC2F1 với chỉ thị RM316 ở hình 20 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 55, 56, 57, 66.
Hình 19. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị ART5
ADN: 1AS996, 2. IR64Sub1, Các giếng ký hiệu từ C67-C328: Các cá thể BC2F1
Hình 20. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM316
Sàng lọc các cá thể BC2F1 với chỉ thị RM105 ở hình 21 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 8, 12, 14, 17, 19, 25, 31, 45.51.
Sàng lọc các cá thể BC2F1 với chỉ thị RM7175 ở hình 22 cho thấy cá thể tái tổ hợp mang băng đồng hợp tử giống nhận gen ở giếng số 4, 5, 6, 9, 20 21, 31, 32, 34, 35, 57, 61.
Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra đƣợc 17 cá thể tái tổ hợp.
Để lựa chọn cá thể mang nền gen lớn nhất của cây nhận gen sử dụng 20 chỉ thị nằm trên 11 nhiễm sắc thể đƣợc tiến hành với 17 cá thể tái tổ hợp trên.
Hình 21. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM105
ADN: 1.AS996, 2. IR64Sub1, giếng 3-53: các cá thể BC2F1
Hình 22. Sàng lọc các cá thể BC2F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị RM7175
ADN: 1AS996, 2. IR64Sub1, giếng 3-68: các cá thể BC2F1
1 2 3 1 2 3
Số liệu của từng cá thể đƣợc đƣa vào phân tích trên chƣơng trình Graphical Genotyper để lựa chọn cá thể BC2F1 tốt nhất. Cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ đƣợc lựa chọn để lai tạo thế hệ BC3F1.
Kết quả cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442 -11 và P442 -14. Cá thể có nền gen cây nhận gen thấp nhất là 89,7% ở cá thể số P39-80. Ngoài ra, còn có các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây nhận gen là 92,25%. Các cá thể có mang gen Sub1 và có nền gen cây nhận gen cao nhất là P442 -11 và P442 -14. P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 đƣợc chọn để lai tạo quần thể BC3F1.
3.3.4. Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC3F1
Tƣơng tự nhƣ với quần thể BC2F1 cho thế hệ BC3F1 với 445 cá thể. Sử dụng hai chỉ thị ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1 ở thế hệ BC3F1. Kết quả đƣợc minh họa ở hình 23 và 24.
Khi phân tích các cá thể BC3F1 với chỉ thị SC3 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống cho gen ở giếng số 49 và giống nhận gen ở giếng số 50 là giếng số 3, 5, 6, 8, 10, 14, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 30, 31, 32, 33, 35, 39, 40, 41, 42, 43, 46, 47.
Những giếng còn lại các cá thể đều mang băng của giống nhận gen AS996.
Hình 23. Sàng lọc các cá thể BC3F1(AS996/IR64Sub1) với chỉ thị SC3 Giếng 1: 25bp
Khi phân tích các cá thể BC3F1 với chỉ thị ART5 những cá thể dị hợp tử mang 2 băng của cả giống nhận gen và giống cho gen là giếng số 5, 6, 10, 16, 17, 19, 22, 23, 24, 25, 28, 31, 32, 34, 35, 36, 38, 41, 43, 44, 45, 50, 51.
Các giếng còn lại các cá thể chỉ cho băng của AS996