1.4.2.1 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen sinh vật sử dụng các chỉ thị phân tử đƣợc phát triển nhanh chóng. Chỉ thị phân tử cho phép xác định đƣợc
các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gen hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn. Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng, theo dõi và phát hiện đƣợc các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chƣa có sự biểu hiện ra kiểu hình. Điều này giúp công tác chọn tạo giống tiền hành một cách chính xác, rút ngắn thời gian và chi phí.
Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay ngƣời ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy định các tính trạng nông sinh học khác nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này. Nhờ vào những ƣu điểm của chỉ thị phân tử đó là:
- Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó.
- Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trƣởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trƣờng đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá đƣợc nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật.
- Loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của mối tƣơng tác giữa các alen khác nhau của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng.
- Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình.
- Số lƣợng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân biệt đƣợc sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt đƣợc giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh.
- Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm...
1.4.2.2. Những ứng dụng của chỉ thị phân tử
Phân tích đa dạng di truyền
Nhờ sự ra đời của các loại chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà khoa học một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng nhƣ nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng.Ƣu điểm của CTPT trong phân tích đa dạng di truyền là rút ngắn thời gian chọn lọc đối với các tính trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình. Các chỉ thị phân tử thƣờng đƣợc sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dƣới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài. Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ƣu thế lai giữa các cặp bố mẹ. (Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thƣờng sẽ cho ƣu thế lai lớn hơn).
RFLP là một trong những chỉ thị hình thành sớm nhất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền. Wangz và ctv đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế sơ đồ cây chủng loại phát sinh ở lúa. (Wangz và ctv, 1992)[90] Jena. S và ctv đã dùng RAPD để xác định đa dạng cấu trúc ADN cây họ đậu. (Jena. S và ctv, 2004)[52] Lƣu Minh Cúc và ctv đã sử dụng SSR để khảo sát đa dạng di truyền một số giống lúa nếp phục vụ cho xây dựng quy trình tính khác biệt của giống lúa hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS (Lƣu Minh Cúc, 2010)[7]. Chỉ thị phân tử ADN còn đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu sự sai khác ADN giữa các giống đột biến so với các giống gốc ở thực vật.
Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử ADN là tìm chỉ thị liên kết gen (Gene tagging) và lập bản đồ gen. Chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử. Bản đồ đối với tính trạng số lƣợng (QTL) thƣờng có rất ít thông tin về sự kiểm soát của gen. Nhƣng nó vô cùng quan trọng, vì hầu nhƣ các tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi đều yêu cầu bản đồ QTL. Ngƣời ta cần phải quét từ đầu đến cuối hệ gen với những chỉ thị bao phủ toàn bộ các NST, với khoảng cách trung bình 10cM giữa 2 chỉ thị.
Thông qua đó, ngƣời ta xác định những khu vực giả định có chứa các gen điều khiển tính trạng số lƣợng mà ta đang nghiên cứu.
Những chỉ thị đƣợc ứng dụng trong chọn giống cây trồng phải liên kết chặt với gen mục tiêu, trên cơ sở bản đồ di truyền phân tử.
Bản đồ di truyền lúa đầu tiên đƣợc thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm 1963, gồm 12 nhóm liên kết. Vào những năm 70 của thế kỷ XX, nhiều nhà di truyền chọn giống đã đề xuất bản đồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (Trisomic). Sau đó bản đồ di truyền liên kết ở lúa đƣợc thiết lập trên cơ sở các chỉ thị đột biến hình thái và các chỉ thị izozym (Ishikawa và ctv, 1991; Wu và ctv, 1993)[48][93].
Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng trên 30 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, trên 20 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn và rầy nâu đã đƣợc phát hiện. Ngoài ra, nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa nhƣ chịu ngập, hạn, mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tƣơng hợp rộng... cũng đƣợc lập bản đồ phân tử để đƣa vào sử dụng trong chọn giống. Lƣu Thị Ngọc Huyền và ctv bằng kỹ thuật AFLP để xác định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu ở lúa CR203 (Thông tin CNSH ứng dụng, 2001)[14]. Michael J. Thomson và ctv đã lập bản đồ QTL và bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại tạo giống lúa chống chịu mặn. (Michael J. Thomson, 2010)[88] Nguyễn Thị Lan Hoa và ctv đã sử dụng các chỉ thị SSR cho đa hình lập bản đồ các nhóm liên kết trong hệ gen và xác định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ. (Nguyễn Thị Lan Hoa, 2009)[10]
Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng nhƣ một phƣơng tiện hữu ích trong quy trình tạo giống mới. Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn.
Mặt khác chỉ thị hình thái vốn có số lƣợng không nhiều, những chỉ thị liên kết với gen quan tâm lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ CTPT các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại -MABC) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới.
Thông thƣờng, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, ngƣời ta đƣa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phƣơng pháp lai trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo. Bằng phƣơng pháp này việc đƣa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ƣu việt thƣờng gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện đƣợc (Mohan và cs., 1997) [65]. Còn đối với quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, nguồn gen mới nhập đƣợc phát hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó.
Nguyên lý của phƣơng pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen. (Thomson và ctv., 2009; Septiningsih và ctv., 2009; Singh và ctv., 2009).[87][77][78] Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cƣờng nền di truyền qua mỗi thế hệ. Ƣu điểm chính của phƣơng pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locut gen đích; (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp, (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết, và (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm. Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ đƣợc thể hiện trên đồng ruộng (Singh và ctv., 2009, Sarkar và ctv., 2009)[78][76] Ngoài ra, thông qua phƣơng pháp này, tốc độ của quá trình chọn lọc đƣợc đẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 là đạt kết quả tƣơng đƣơng với BC6 theo phƣơng pháp thông thƣờng.
IRRI đã lập bản đồ chính xác QTL liên kết với tính trạng chịu ngập (Sub1) nằm trên nhiễm sắc thể số 9, và đã thành công đƣa vào 6 giống lúa cho vùng ngập bằng phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại. Sáu giống lúa đƣợc chuyển gen Sub1 là những giống phổ biến đƣợc nông dân trồng ở Nam và Đông Nam châu Á; Swarna, Sambha Mahsuri, IR64, BR11, TDK1 và CR1009, những giống này đã đƣợc trồng với diện tích trên triệu ha, đạt năng suất từ 1-3,5 tấn/ha trong điều kiện ngập hoàn toàn trong giai đoạn lúa con gái. Phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) cũng đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 1, và đã thành công trên ba giống lúa trồng đại trà BR11, BRRI dhan28 và IR64.
Để đánh giá các giống lúa có mùi thơm Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu đã nghiên cứu di truyền mùi thơm trên lúa và nhận thấy rằng gen mùi thơm đƣợc kiểm soát bởi một gen lặn và chỉ thị ADN liên kết với gen mùi thơm từ đó có thể phát hiện thể đồng hợp tử và dị hợp tử ngay từ thế hệ ban đầu. (Nguyễn thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004)[17].
Lƣu Thị Ngọc Huyền và ctv đã dùng chỉ thị SSR để tạo giống lúa thuần kháng rầy nâu cho ĐBSH và ĐBSCL (Lƣu Thị Ngọc Huyền, 2010)[15]. Lã tuấn Nghĩa cũng sử dụng chỉ thị SSR để tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất chất lƣợng cao. (Lã Tuấn Nghĩa, 2011)[19]
1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CHỊU NGẬP
1.5.1. Những nghiên cứu chọn tạo giống chịu ngập trên thế giới
Nghiên cứu giống lúa nƣớc sâu, giống lúa chống lụt đã có từ lâu ở châu Á. Chƣơng trình khảo nghiệm lúa nƣớc sâu quốc tế từ năm 1976 đã đƣợc thực hiện liên tục với nhiều báo cáo trong những hội nghị quốc tế về lúa gạo (Thái Lan 1976, Ấn Độ 1978, Thái Lan 1982, Úc 1985). Các nhà khoa học nghiên cứu lúa nƣớc sâu phần lớn chú ý vào đặc tính khả năng vƣơn lóng của lúa nên nghiên cứu các giống
lúa nổi là trọng tâm vào thời bấy giờ.
Công trình nghiên cứu về lúa nƣớc sâu đƣợc công bố từ năm 1934 tại trạm lúa nổi Habiganj – Bangladesh. (Jackson và Vergara 1979)[51] Công trình tập trung vào việc nghiên cứu tuyển chọn giống cải tiến, ảnh hƣởng của tuổi mạ đối với tính chịu ngập, điều kiện đất đai, thời vụ và phƣơng pháp gieo sạ.
Năm 1941, Ramiah và Ramaswami đã công bố một chƣơng trình nghiên cứu về di truyền tính trạng nổi của cây lúa. Đặc tính tăng trƣởng theo kiểu ngã rạp (bò) của lúa nổi do hai gen lặn, lặp đoạn điều khiển, một gen liên kết với gen trội của tính chín muộn. Những phát hiện chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu quần thể F2 đƣợc trồng trong điều kiện nƣớc cạn của các cặp lai, giữa lúa nƣớc sâu với giống không phải nuớc sâu của Ấn Độ, Bangladesh, Pakistan. Tác giả cho rằng không có khả năng vƣơn lóng của những cây đang phân ly. (Ramiah và Ramaswami, 1941)[72]
Năm 1965, Chang xác định thêm về hai gen lặn dw1 và dw2 điều khiển tính trạng nổi.[31]
Tất cả các giống lúa nổi đƣợc biết hiện nay thuộc loại hình Indica, chƣa thấy giống lúa nổi loại hình Japonica, cũng nhƣ chƣa truyền đƣợc gen nổi của Indica
vào Japonica (Oka 1975)[69]. Tác giả lƣu ý: có vài giống lúa không thể hiện tính vƣợt nƣớc nhƣng vẫn có thể có gen nổi bởi có tổ tiên của nó là giống hoang dại, có sự khác biệt một cách đáng chú ý về khả năng nổi từ trung bình đến mạnh. Khả năng nổi là yếu tố thuộc dạng hình hoang dại và nửa hoang dại để cây lúa thích nghi với chế độ nƣớc thay đổi bất thƣờng.
Sự vƣơn dài lóng thân của giống lúa nƣớc sâu địa phƣơng xảy ra ở cây mạ 4 tuần tuổi, trong khi đối với loại hình cải tiến (nửa lùn) là 10 tuần tuổi. Các giống lúa nổi vƣợt nƣớc giỏi nhất có xu hƣớng trỗ muộn nhất, thích nghi với điều kiện ngập lụt, nƣớc rút khô chậm. Tác giả còn ghi nhận: lúa nổi khác với lúa thƣờng là sự kéo dài lóng thứ 5 và 6 khi cho phản ứng với GA (gibberellic acid). (Inouye và ctv. 1985)[49].
Các trạm nghiên cứu lúa nƣớc sâu đều bắt đầu thực hiện việc cải tạo giống bằng cách chọn các giống lúa địa phƣơng đƣợc sử dụng nhiều trong các chƣơng
trình lai tạo giống là: Leb Mue Nahng 111, Pingaew 56, Chamara, Khama, Baisbish về khả năng vƣợt nƣớc. FR13A, Goda Heenati, Kurkaruppan, Thavalu, Saran Kraham về khả năng chịu ngập.
Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật AFLP để phân tích bản đồ di truyền trên cơ sở quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL), quần thể F8 của tổ hợp lai IR74 x Jalmagna (Sripongpankul 1998)[82]. Tác giả đã sử dụng 247 dòng lai để đánh giá kiểu hình, áp dụng với 201 chỉ thị phân bố trên 12 nhiễm sắc thể lúa, với sự phối hợp của 20 cặp mồi của Pst1 và Mse1 thấy rằng 9 QTL phối hợp với tính trạng vƣơn cao thân định vị ở nhiễm sắc thể số 1, 4, 5, 6, 10 và 12 . Sáu QTL phối hợp với tính trạng vƣơn lóng thân định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 4, 5, 6, và 10. Ba QTL phối hợp với tính trạng vƣơn dài của lá định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 4, và 12.(Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003)[6]
Với lúa chịu ngập hoàn toàn thì từ những năm 1950, các nhà khoa học phát hiện ra giống bản địa của Ấn Độ có khả năng này. Những năm 1980 công tác chọn tạo giống chống chịu ngập bắt đầu đƣợc tiến hành. Năm 1993 có giống lúa bán lùn năng suất cao chịu ngập đầu tiên. Năm 1995 gen Sub1 đã đƣợc lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 9. Năm 2002 C. N. Neeraja và ctv đã dùng phƣơng pháp MABC chọn tạo giống SwanaSub1 từ giống Swana của Ấn Độ lai với giống IR49830-7 mang gen Sub1 có nguồn gốc từ FR13A., chỉ thị 464A với khoảng cách là 3,4 cM và SSR1 với khoảng cách 0,7 cM, chỉ thị RM316 với khoảng cách 1,5 cM đã đƣợc sử dụng để chọn lọc cây mang gen kháng, đến thế hệ BC3F2 đã nhận đƣợc cây lai mang gen Sub1 có nền di truyền của Swana. Năm 2006, Neeraja phát hiện gen Sub1A là gen chính điều khiển tính chống chịu ngập.(C. N. Neeraja,2007)[34]. Năm