2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu
- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu ngập đầu tiên tại Philippines đã đƣợc công nhận trong cuộc Họp Hội đồng thƣ ký lần thứ 27 ngày 7 tháng 7 năm 2009.
- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lƣợng cao đƣợc bộ Bộ môn Di truyền chọn giống Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL, chọn lọc từ tổ hợp lai IR 64/Oryza rufipugon. AS996 có tên gốc là OM2431-996 đƣợc công nhận giống chính thức theo Quyết định số 5310 QĐ/BNN-KHCN, ngày 29 tháng 11 năm 2002 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT. Giống có thời gian sinh trƣởng 90-95 ngày, chiều cao cây 95 - 100 cm, thân cây cứng, đẻ nhánh khá, chịu phèn tốt, kháng vừa với bệnh đạo ôn, nhiễm nhẹ với bệnh khô vằn và rầy nâu. Năng suất: vụ Đông Xuân 6-8 tấn/ha, vụ Hè Thu 4-5 tấn/ha. Là một trong những giống lúa chủ lực trong cơ cấu giống của ĐBSCL với diện tích gieo trồng 30.000ha/vụ.
- Một số giống lúa đang đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam nhƣ Q5c, Q5l, OM5472, FL478, IR64SUB1, AS996, KDDB, BT.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
- 372 chỉ thị SSR phân bố rải rác trên12 NST (phụ lục 1)
- Các vật tƣ, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng(phụ lục 2)
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phƣơng pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận gen kháng. Kết hợp với phƣơng pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang gen kháng và nền gen tối đa của giống nhận gen.
- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phƣơng pháp CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trƣờng đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ).
- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phƣơng pháp PCR đối với các chỉ thị SSR liên kết với QTL quy định tính chịu ngập chìm (Sub1). Chọn lọc nền gen thông qua phƣơng pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa.
- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide. - Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc.
- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe. - Phân tích dữ liệu trên chƣơng trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008)[89].
2.2.1. Phƣơng pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận gen chịu ngập ngập
AS996 đƣợc chọn làm cây mẹ và IR64Sub1 đƣợc chọn làm cây bố để lai tạo con lai F1, sử dụng phƣơng pháp lai hữu tính (thụ phấn bằng tay). Hoa lúa chƣa tung phấn của cây AS996 đƣợc khử đực bằng cách cắt bỏ 6 bao phấn của mỗi hoa, sau đó lấy hạt phấn của cây IR64Sub1 thụ phấn cho cây AS996. Sau 30 ngày thu hạt lai F1.
Các hạt lai F1 đƣợc trồng đến khi đƣợc 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập bằng chỉ thị phân tử. Chọn lọc các cá thể dị hợp tử mang gen chịu ngập để lai trở lại với giống AS996 (làm bố) tạo quần thể BC1F1. Các cá thể BC1F1 đƣợc trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen chịu ngập và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử. Chọn những cá thể mang gen chịu ngập và có nền di truyền lớn nhất của giống AS996 để lai trở lại với dòng nhận gen tạo BC2F1.
Tiếp tục các công việc nhƣ từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm 1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang gen kháng, chọn đƣợc dòng mang gen chịu ngập chìm và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số
ADN lúa đƣợc tách chiết và tinh sạch theo phƣơng pháp CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trƣờng đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ)
Các bước tiến hành
Phƣơng pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phƣơng pháp của Shagai – Maroof (năm 1984). Quy trình thực hiện gồm các bƣớc:
- Lá của các giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần. Mẫu đƣợc lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN.
- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.
- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đá và thêm 50l SDS 10%.
- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho dịch đƣợc trộn đều.
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút.
- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tƣợng kết tủa muối.
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.
- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho 400l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bƣớc này có thể giữ ở 40C qua đêm.
- Cho 3l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng. - Thêm 400l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.
- Cho và tủ hút, thêm vào 800l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.
- Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).
- Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C).
- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đáy ống.
- Rửa tiếp bằng 400l cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100l TE (10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.
- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Phƣơng pháp PCR với mồi SSR
Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lƣợng của các chất trong mỗi phản ứng nhƣ trong bảng 5.
Bảng 5. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
Stt Thành phần Thể tích (l)
1 H2O cất khử trùng 8.95
2 Buffer 10X 1,5
3 MgCl2 (50mM) 0,45
4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5M 0,5
7 Primer Revert 5M 0,5
8 ADN (35ng/ l) 2,0
Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lƣợng các chất cần thiết, tiến hành đặt chƣơng trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR nhƣ sau:
Bảng 6. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (o
C) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể
2.2.4. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%
Các bước tiến hành
- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác.
- Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất.
- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5l ethidium bromide (10 mg/ml) và lắc đều.
- Chuẩn bị khay và lƣợc. Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.
- Rút lƣợc, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm. - Tra sản phẩm PCR đã đƣợc trộn với Xylen cyanol vào giếng. tỷ lệ 5l Xylen cyanol /15l mẫu. Thời gian và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi SSR cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp.
2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide.
2.2.5.1. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính
Chuẩn bị kính
- Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
- Lau tấm kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chú ý. Tránh làm dính dung dịch này lên tấm kính ngắn.
- Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thành bằng cách thêm 2l Bind Silane vào 1ml chứa 95% ethanol và 5% glacial acetic acid.
- Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
- Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị gel polyacrylamide
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nƣớc)
- Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào 1 cốc đong 100ml. Thêm 300l 10% APS (ammonium persulfate) và 60l TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.
- Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí.
- Cài lƣợc vào giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoài). Dùng kẹp cố định lƣợc.
- Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Điện di
- Tháo lƣợc và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính. - Lắp ráp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X vào buồng đệm trên và dƣới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel.
92 - 100W.
- Biến tính các sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt vào trong đá và phủ đá lên trên ít nhất 5 phút.
Sản phẩm PCR lúc này đã đƣợc trộn với 4l Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).
- Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã đƣợc làm biến tính, các mẫu chạy với ladder 50 bp.
Thời gian tra mẫu không kéo dài quá dài để gel không bị nguội đi nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60W và ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thƣớc từng mồi sử dụng.
Phương pháp nhuộm bạc + Chuẩn bị các dung dịch
- Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid và 900ml nƣớc cất.
- Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thành bằng cách hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) vào 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thêm 1,5ml formaldehyd
(H2CO)37%.
- Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất và làm lạnh ở -200
C.
Chú ý. (Trƣớc khi sử dụng thêm 1,5ml formaldehyd (H2CO) 37% và 200l natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
+ Tiến hành nhuộm
Sau khi chạy điện đi, tháo gỡ tấm kính bám gel và tiến hành các bƣớc sau:
- Cố định gel: Đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng và để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch này để dùng cho bƣớc sau.
- Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thêm formaldehyd và sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giây.
- Đƣa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trên trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiên sau đó ghi nhận kết quả.
2.2.5.2. Phƣơng pháp điện ditrên gel polyacrylamide không biến tính
Chuẩn bị dung dịch 6%,acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g trong 1 lít dung dịch)
Chuẩn bị kính
Rửa kính bằng xà phòng sau đó rửa sạch lại bằng nƣớc cất. để khô tự nhiên hoặc lau bằng giấy lau,
Chọn mặt kính bám gel, lau lại bằng nƣớc cất khử trùng 2 lần sau đó lau lại bằng cồn 70% 2 lần.
Giữ tấm kính dài, kẹp miếng lót cao su từ một đầu của tấm kính đến hết tấm kính, miếng lót phải bịt kín các góc. Sau đó đặt 2 thanh kẹp ở hai bên của tấm kính dài.
Lau tấm kính ngắn 2 lần bằng nƣớc cất khử trùng sau đó lau lại với còn 70%. Đặt tấm kính ngắn lên trên tấm kính dài sao cho không bị hở và dùng kẹp kẹp chặt hai tấm kính với nhau.
Chuẩn bị dung dịch gel
Dung dịch đƣợc chuẩn bị trong cốc đong với một thanh khuấy từ và thêm các thành phần 50l TEMED (N,N,N‘,N‘-Tetraethyl - ethylendiamine) và 250l APS 20%, 2,5ml TBE 10X, 7,5ml 40% acrylamide, 39,44 ml H2O)
Đổ từ một góc cho đến khi gel đầy tấm kính ngắn, cài lƣợc sao cho để răng lƣợc hƣớng vào trong.
Sau 15 phút gel đông lại có thể dùng.
Điện di
Bỏ kẹp hai bên kính, lấy miếng lót cao su ra, lắp vào bể điện di sao cho không để lại bọt khí dƣới tấm kính, thêm đệm TBE 0,5x ngập mặt gel khoảng 0,5cm.
Rút lƣợc ra và tra khoảng 7l mẫu cho mỗi giếng (đã thêm dye) các mẫu chạy với marker chuẩn 25bp.
Điện di từ 1,5 – 5h ở 100V tùy từng kích thƣớc cặp mồi pcr và tùy từng nồng độ gel.
Nhuộm gel
Sau khi điện di xong, tháo kính, lấy gel ra cho vào một hộp kín có chứa TBE 0,5X. Cho dung dịch nhuộm Syber Safe 5l cho mỗi gel, ngâm trong 30 phút. Sau đó chụp ảnh bằng máy soi UV.
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc ghi nhận trong chƣơng trình Excel và xử lý trong chƣơng trình Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008) nhƣ sau:
-Ghi nhận dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận gen là ―A‖, đồng hợp tử giống cho gen là ―B‖ và dị hợp tử là ―H‖, số % alen của cây nhận gen là ―R‖.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN TỔNG SỐ
Tách chiết ADN là bƣớc đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN. Tùy theo từng loại cây và mục đích nghiên cứu mà có thể chọn những phƣơng pháp tách chiết ADN khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB. Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu đƣợc thu để tách chiết ADN. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím. Kết quả tách chiết ADN đƣợc minh hoạ ở hình 3.
Hình 3. Kết quả kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phƣơng pháp CTAB trên gel agarose 0,8%.
Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), Các giếng từ 2 -17: ADN mẫu nghiên cứu.
Kết quả tách chiết ADN cho thấy phƣơng pháp tách chiết ADN bằng CTAB cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Nồng độ trong khoảng từ 200 – 300ng/l khi so sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/l giếng số 1. Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ RNA bằng RNase tiến hành khá tốt thể
hiện các băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN này đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.