* Thí nghiệm 2:Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân chồi in vitro cây Bạch Truật.
Nền môi trường (MTN): MS + 30g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí theo các công thức:
CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l BA CT2: MTN + 0,5 mg/l BA CT3: MTN + 1 mg/l BA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
CT4: MTN + 1,5 mg/l BA CT5: MTN + 2 mg/l BA
* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với BA đến khả năng nhân chồi in vitro
Nền môi trường (MTN): MS + Nồng độ BA cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 2 + 30g/l saccarose + 5,8 g/l agar.
Thí nghiệm được bố trí theo các công thức: CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l Kinetin
CT2: MTN + 0,5 mg/l Kinetin CT3: MTN + 1 mg/l Kinetin CT4: MTN + 1,5 mg/l Kinetin CT5: MTN + 2 mg/l Kinetin
* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BA + Kinetin và αNAA đến khả
năng nhân chồi của cây Bạch Truật trong điều kiện in vitro
Nền môi trường (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 3 + 30g/l saccarose + 5,8 g/l agar.
Thí nghiệm được bố trí theo các công thức: CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l α-NAA
CT2: MTN + 0,5 mg/ α-NAA CT3: MTN + 1 mg/l α-NAA CT4: MTN + 1,5 mg/l α-NAA CT5: MTN + 2 mg/l α-NAA
* Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tổ hợp BA + Kinetin và IBA đến khả
năng nhân chồi của cây Bạch Truật trong điều kiện in vitro
Nền môi trường (MTN): MS + Nồng độ BA và Kinetin cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 3 + 30g/l saccarose + 5,8 g/l agar.
Thí nghiệm được bố trí theo các công thức: CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l IBA
CT2: MTN + 0,5 mg/ IBA CT3: MTN + 1 mg/l IBA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23
CT4: MTN + 1,5 mg/l IBA CT5: MTN + 2 mg/l IBA
3.3.4.3. Nghiên cứu sự tạo rễ cho chồi Bạch truật
- Tiến hành 2 thí nghiệm tạo rễ
- Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ αNAA và IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ của chồi Bạch Truật trong điều kiện in vitro.
* Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độαNAA đến khả năng tạo rễ cho chồi Bạch Truật
Nền môi trường (MTN): MS + 30g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí theo các công thức:
CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l αNAA CT2: MTN + 0,1 mg/l αNAA CT3: MTN + 0,3 mg/l αNAA CT4: MTN + 0,5 mg/l αNAA
* Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cho chồi Bạch Truật
Nền môi trường (MTN): MS + 30g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar Thí nghiệm được bố trí theo các công thức:
CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l IBA CT2: MTN + 0,1 mg/l IBA CT3: MTN + 0,3 mg/l IBA CT4: MTN + 0,5 mg/l IBA
3.3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đèn chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi Bạch truật
- Nghiên cứu được tiến hành trên 4 loại đèn
- Tại môi trường nhân nhanh chồi ở trên lấy công thức nhân chồi tối ưu nhất đem đặt trong bốn công thức đèn chiếu sáng chuyên dụng rồi tiến hành đo đếm các chỉ tiêu, lấy số liệu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24
* Thí nghiệm 8: Công thức được bố trí trên các loại đèn như sau
Công thức Tên và công suất các loại đèn
CT nhân chồi tốt nhất
(Lấy được ở thí nghiệm nhân nhanh)
Đèn T10 - 40w T8 B/R - 36w T8 - 36w Delux
LED: R/B - I as = 35 µMs (m2)
3.3.4.5. Nghiên cứu khả năng tạo củ in vitro chồi Bạch truật
- Tiến hành 3 thí nghiệm tạo củin vitro
* Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo củ
in vitro ngoài sáng cho chồi Bạch Truật
Các công thức được bố trí như sau:
CT1 (ĐC): 1/2 MS + 30 g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar CT2: 1/2 MS + 45 g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar CT3: 1/2 MS + 60 g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar CT4: 1/2 MS + 90 g/l đường saccarose + 5,8 g/l agar
* Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng đường và nồng độ αNAA
đến khả năng tạo củin vitro ngoài sáng cho chồi Bạch Truật
Nền môi trường (MTN): 1/2 MS + hàm lượng đường tối ưu nhất cho khả năng tạo củở thí nghiệm 9 + 5,8 g/l agar. Các công thức được bố trí: CT1 (ĐC): MTN + 0 mg/l αNAA CT2: MTN + 0,1 mg/l αNAA CT3: MTN + 0,3 mg/l αNAA CT4: MTN + 0,5 mg/l αNAA
* Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng tạo củin vitro cho chồi Bạch Truật
Mục đích của thí nghiệm: nghiên cứu điều kiện chiếu sáng đến khả năng tạo củ
in vitro của chồi Bạch truật. Thí nghiệm được bố trí:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
CT1 (ĐC): CT tạo củ tối ưu nhất của đường (ở thí nghiệm 9) đặt trong điều kiện chiếu sáng.
CT2: CT tạo củ tối ưu nhất của đường (ở thí nghiệm 9) đặt trong điều kiện tối hoàn toàn.
* Cách bố trí các thí nghiệm:
Tất cả các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố, mỗi công thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại cấy 3 bình tam giác có chứa 50 ml môi trường nuôi cấy. Mỗi bình cấy 3 mẫu (chồi mầm).
- Đối tượng nghiên cứu: Các chồi tái sinh có kích thước 2 - 3 cm. - Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ 1 tuần một lần.
3.3.5. Các chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Σ Số mẫu sống x 100 Σ Số mẫu nhiễm Tỷ lệ mẫu chết (%) = Σ Số mẫu chết x 100 Σ Số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Σ Số mẫu nhiễm x 100 Σ Số mẫu cấy Tỷ lệ mẫu tạo chồi(%) = Σ Số mẫu tạo chồi x 100 Σ Số mẫu cấy Hệ số nhân TB chồi/Chồi in
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Chiều cao TB của chồi (cm) = Σ ChiΣều cao các ch Số chồi theo dõi ồi theo dõi
Số lá TB của chồi (lá/chồi) = Σ SΣố S lá các chố chồi theo dõi ồi theo dõi
Tỷ lệ ra rễ TB (%) = Σ Số mẫu ra rễ x 100
Σ Số mẫu cấy
Chiều dài rễ TB (cm) = Σ chiều dài rễ
Σ Số rễ
Số rễ trung bình
(rễ/chồi) = Σ SΣố m Sốẫ ru cễ ấy
Khối lượng củ tươi
Trung bình (mg/củ; mg/mẫu) = Σ KhΣố Si lốượ mng cẫu nuôi củ tạo thànhấy
Khối lượng củ khô
trung bình (mg/củ; mg/mẫu) = Σ KhΣ Sốối l mượẫng cu nuôi củ sấy khô ấy
- Bằng cảm quan đánh giá 3 mức:
+ Sinh trưởng tốt (+++): chồi mập, chất lượng chồi đồng đều, thân chồi vừa phải, lá xanh đậm.
+ Sinh trưởng trung bình (++): chồi hơi cao, lá màu xanh nhạt, cụm chồi phát triển hơn mức yếu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu:
Các số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Microsoft Excel (2003; 2007 và 2010) và IRRISTAT 5.0.
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (độ tin cậy là 95%)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu ban đầu:
4.1.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1%đến hiệu quả khử trùng
Đây là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ bên ngoài (vô số vi sinh vật) vào điều kiện nuôi cấy in vitro (vô trùng). Vì vậy đối với tất cả các loại mẫu nuôi cấy khác nhau việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân in vitro. Quá trình này cần phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp - Tỷ lệ mẫu sống cao
- Mô nuôi cấy sinh trưởng tốt.
Trong quá trình khử trùng, loại chất, nồng độ, thời gian khử trùng đều ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm nấm, khuẩn hay mẫu chết. Nồng độ, thời gian khử trùng lớn hay nhỏ quá đều ảnh hưởng đến sự tái sinh mẫu trong quá trình nhân in vitro.
Tác động của chất khử trùng HgCl2 0,1% ở 4 ngưỡng thời gian 3, 6, 9 và 12 phút đến tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu nhiễm sau 4 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 4.1.A. Bảng 4.1.A. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu (Sau 4 tuần) CT Thời gian Tỷ lệ % mẫu sống Tỷ lệ % mẫu chết Tỷ lệ % mẫu nhiễm CT1 3 12 8 80 CT2 6 20 30 50 CT3 9 10 52 38 CT4 12 7 65 28 CV% LSD5% 4,8 3 3 1,32 1,25 2,05
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Hình 4.1.A. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả
khử trùng hạt Bạch truật
Kết quả cho thấy:
+ Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% phụ thuộc vào thời gian ngâm mẫu. Tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm mẫu; Khi tăng thời gian khử trùng từ 3 lên 12 phút, tỷ lệ nhiễm giảm từ 80% xuống còn 28%; ngược lại, tỷ lệ mẫu chết lại tăng từ 8 ÷ 65%. Cho thấy tỷ lệ mẫu sống thu được không những phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu nhiễm mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu chết. Trong 4 mức thời gian khử trùng, công thưc 2 (thời gian 6 phút) cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 20%.
4.1.2. Ảnh hưởng của PRESEPT 0,5% (0,5% Troclosene sodium NaDCC) đến hiệu quả khử trùng hiệu quả khử trùng
PRESEPT 0,5% là chất khử trùng bề mặt rất tốt, vì vậy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác động của chất khử trùng PRESEPT 0,5% (0,5% Troclosene sodium NaDCC) ở 4 ngưỡng thời gian 3, 6, 9 và 12 phút.
0 5 10 15 20 T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng ( % ) 03 phút 06 phút 09 phút 12 phút Thời gian khử trùng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Hình 4.1.B. Ảnh hưởng của 0,5% Troclosene sodium (NaDCC) đến hiệu quả
khử trùng hạt Bạch truật
Bảng 4.1.B. Ảnh hưởng PRESEPT 0,5% (Troclosene sodium NaDCC) đến hiệu quả khử trùng mẫu (Sau 4 tuần) CT Thời gian Tỷ lệ % mẫu sống Tỷ lệ % mẫu chết Tỷ lệ % mẫu nhiễm CT5 3 5 15 80 CT6 6 8 24 68 CT7 9 14 35 51 CT8 12 12 42 46 CV% LSD5% 4,4 1,3 1,6 0,84 0,63 1,09
Tương tự như trên, đối với PRESEPT 0,5%, tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian ngâm mẫu; Khi tăng thời gian khử trùng từ 3 lên 12 phút, tỷ lệ nhiễm giảm từ 80% xuống còn 46%; ngược lại, tỷ lệ mẫu chết lại tăng từ 15 ÷ 42%. Trong 4 mức thời gian khử trùng, CT7 (thời gian 9 phút) cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 14%.
Kết luận:
Với hạt Bạch truật, khi sử dụng HgCl2 0,1% thời gian ngâm mẫu 6 phút là tối ưu nhất. 0 5 10 15 03 phút 06 phút 09 phút 12 phút Thời gian khử trùng T ỷ l ệ m ẫ u s ố ng ( % ) 03 phút 06 phút 09 phút 12 phút
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
4.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi:
Liang Xiao-min và cs (2009) nghiên cứu thiết lập hệ thống nhân nhanh giống cây Bạch Truật và sàng lọc các môi trường nuôi cấy tối ưu nhất. Với việc nuôi cấy chồi đỉnh cây Bạch Truật. Môi trường MS được bổ sung thêm các thành phần như BA, NAA, IBA… với các nồng độ phù hợp khác nhau đã được thiết lập để làm môi trường nuôi cấy gây tăng sinh chồi đỉnh cây Bạch Truật.
Bizeng Mao và cs (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của chồi và cảm ứng ra rễ của cây Bạch truật trong y học cổ truyền Trung Quốc. Phát triển quy trình tái sinh cây hiệu quả trên cây bạch truật, tái sinh cơ quan thông qua chồi, nhân trên môi trường Murashige - Skoog (MS) bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (BA, NAA) ở các nồng độ khác nhau.
Tao Yuan-jing và cs (2010) đã thực hiện các thí nghiệm nuôi cấy mô chồi đỉnh và tối ưu hóa điều kiện nhân nhanh giống cây Bạch Truật. Những chồi đỉnh của cây Bạch Truật đã được sử dụng để nuôi cấy nhằm sản xuất cây con giống trong
in-vitro. Nghiên cứu chỉ ra rằng chồi đỉnh thích hợp cho nuôi cấy có kích thước từ 1 đến 2 cm.
Từ các nghiên cứu tổng hợp trên chúng tôi sử dụng các chồi tái sinh có kích thước từ 2 - 3 cm có được từ các thí nghiệm khử trùng tạo nguồn vật liệu ban đầu ở trên để tiến hành các thí nghiệm nhân nhanh trên môi trường MS (Murashige - Skoog) có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau.