3. Ý nghĩa khoa học thực tiễn
2.4.4.Phản ứng Real Time PCR (R T PCR)
Phản ứng Real Time RT - PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các ựặc ựiểm của quá trình sao chép DNA. Real Time RT - PCR cho phép phát hiện và ựịnh lượng sự tắch lũy DNA khuếch ựại ngay khi phản ứng ựang xảy ra. Khả năng này ựược phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết ựặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tắn hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp ựược tắn hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch ựại xảy ra. Ban ựầu, tắn hiệu huỳnh quang còn ở tắn hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tắn hiệu cho dù có quá trình khuếch ựại và sản phẩm ựã tăng theo hàm mũ. đến một thời ựiểm xác ựịnh, sản phẩm khuếch ựại ựã tạo ra ựủ tắn hiệu huỳnh quang có thể phát hiện ựược. Chu kỳ này ựược gọi là chu kỳ ngưỡng Ct
(cycle of threshold). đây là giá trị ựể ựánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT - PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là Reverse Transcription nên phương pháp này ựược gọi là Real Time RT - PCR.
+ Nguyên lắ hoạt ựộng của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất ựược sử dụng trong phản ứng Real Time RT - PCR là Taqman probe.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Taqman probe ựược sử dụng như một trình tự oligonucleotide ựặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Bảng 2.1. Primer và probe dùng xác ựịnh nhiễm virus cúm A/H5N1 và H7N9 PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5' - 3') Modification 5' 3' M-4 (CDC)
Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None
Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
H5-3S (AAHL+ Probe HA 2-3)
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA HEX BHQ1
Probe TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA TET BHQ1
Forward ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT TCA None None
Reverse AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC None None
N1-2 (China)
Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None
Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None
H7-6 (CODA)
Probe TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG FAM BHQ1
Forward GYAGYGGYTACAAAGATGTG None None
Reverse GAAGACAAGGCCCATTGCAA None None
N9-1 (CNIC)
Probe AGACAATCCCCGACCGAATGAATGACCC FAM BHQ1
Forward TAGCAATGACACACACTAGTCAAT None None
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở ựầu 5Ỗ- và một chất hấp phụ huỳnh quang ở ựầu 3Ỗ-. Khi còn nguyên vẹn, tắn hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ.
Trong giai ựoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch ựại, probe liên kết với trình tự ựắch và hoạt ựộng 5Ỗ - 3Ỗ exonuclease ựặc hiệu cho DNA mạch ựôi của Taq sẽ cắt ựứt ựầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tắn hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch ựại trong mẫu.
Các bước tiến hành phản ứng Real Time RT Ờ PCR
Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra mẫu và ựể lựa chọn mẫu ựạt yêu cầu xét nghiệm; tiến hành xét nghiệm theo quy trình của phương pháp RT- PCR. Các bước tiến hành phản ứng RT Ờ PCR bao gồm:
Chiết tách RNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch ựệm RLT bổ sung β - Mecraptoethanol (β - ME) tỷ lệ 1/100 và dung dịch ựệm rửa RPE bổ sung 4 lần thể tắch ethanol. Mẫu sau khi ựược xử lắ sẽ tiến hành chiết tách. Các bước chiết tách theo hình 2.1:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 600ộl ựệm RLT. 200ộl mẫu. Vortex trong 1 phút. 400 ộl cồn tuyệt ựối 100%. Vortex 15 giây, spin nhẹ. Gắn cột lọc và ựiều chỉnh hệ thống máy hút chân không.
Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc.
700ộl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc. 500ộl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc. Lặp lại lần 2. Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm
1200 vòng/phút trong 2 phút. Lấy cột lọc cho vào ống
eppendorf. 50ộl nước Rnase - free. Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút. Thu lấy RNA.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 Giữ RNA ở 40C ựể xét nghiệm trong vài giờ, lưu giữ ở -200C nếu chưa xét nghiệm ngay trong ngày.
Chuẩn bị Master mix
Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất ựệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương ựồng giữa primer và bộ gen ựã chiết tách. Quá trình Master mix ựược tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống eppendorf, vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như bảng 2.2:
Bảng 2.2. Các thành phần trong Master mix
Reagent Lượng/1 mẫu (ộl)
Nước 10,5 5x Reaction mix 5,0 MgCl2 1,2 D NTP 0,8 P.P.P (mồi) 1,5 Enzyme mix 1,0 Tổng 20
Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf ta tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15giây. Các nguyên liệu ựược sử dụng có trong bộ kit Qiagen
Template mẫu
Template là quá trình chuẩn bị các ống mẫu trước khi chạy trên máy RT - PCR. Trước khi template mẫu, chuẩn bị ống PCR tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn ựoán. Sau ựó tiến hành theo các bước sau:
- Cho 20ộl hỗn hợp Master mix vào ống PCR.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 Tube mẫu.
- Cho 5ộl mẫu ựối chứng (+) vào hỗn hợp Master mix của Tube ựối chứng dương (postive).
- Cho 5ộl nước Free RNase vào hỗn hợp Master mix của Tube ựối chứng âm (negative).
Chạy máy Real Time RT - PCR
Chu trình nhiệt cho phản ứng RT - PCR phát hiện cúm gia cầm type A/H5N1, H7N9
Bảng 2.3. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Real Time RT - PCR
RT (bước phiên mã ngược) PCR
500C - 30 phút
40 chu kỳ x (950C - 10 giây + 580C - 50 giây) 950C - 2 phút
đọc huỳnh quang ở bước Annealing - extension (=600C trong 30 giây).
đọc kết quả
Kết quả xét nghiệm ựược công nhận khi:
đối chứng dương (+) cho giá trị Ct ựã biết (ổ2) đối chứng âm (-) không có Ct (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu dương tắnh khi giá trị Ct ≤ 35,0 Mẫu âm tắnh khi không có giá trị Ct
Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35,0
Trình tự các phản ứng Realtime RT-PCR ựể xác ựịnh các gen
Bước 1: Tách ARN với bộ kắt Qiagen (Hilden. Germany) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bước 2: ARN ựược khuếch ựại với kắt Qiagen nhằm xác ựịnh sự có mặt của gen M (matrix gene).
Bước 3: Các mẫu dương tắnh với gen M ựược tiếp tục xác ựịnh sự có mặt của gen H5 và H7 bởi kắt Qiagen
Bước 4: Các mẫu dương tắnh với gen H5 ựược xác ựịnh sự có mặt của gen N1, các mẫu dương tắnh với H7 ựược tiếp tục xác ựịnh sự có mặt của gen N9 bởi kắt Qiagen
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41