3.3.2.1. Khảo sát hình thái tế bào
Tế bào VKQH tắa ựược nuôi trong môi trường dịch thể SA hoặc SSM ở ựiều kiện yếm khắ trong ống nghiệm, ựược chiếu sáng từ 5 - 7 ngàỵ Quan sát hình thái tế bào bằng kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 100X.
3.3.2.2. Xác ựịnh thành phần sắc tố
Nuôi VKQH tắa trong môi trường dịch thể trong 5 ngày, thu sinh khối, rửa tế bào bằng nước cất và huyền phù lại tế bào trong dịch dịch succrose 60%. Dung dịch nồng ựộ cao này chống lại sự tán xạ ánh sáng. Phổ hấp thu ánh sáng cực ựại của sắc tố tế bào ựược xác ựịnh khi quét huyền phù tế bào ở
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
dãy bước sóng từ 190 Ờ 1100 nm bằng máy ựo quang phổ. Dựa vào phổ hấp thu cực ựại của huyền phù tế bào, loại diệp lục ựược xác ựịnh theo bảng 2.3.
- Loại carotenoid chắnh ựược dự ựoán dựa vào tạp chắ hệ thống phân loại vi khuẩn.
3.3.2.2. Khảo sát ựặc tắnh sinh lý
- Việc xác ựịnh nhu cầu và nồng ựộ NaCl, khả năng sử dụng nguồn cacbon và chất cho ựiện tử trong quang hợp và khoảng pH thắch hợp cho sự tăng trưởngẦ ựược thực hiện như sau: sinh khối của chủng khảo sát ựược pha loãng 1000 lần trong nước cất vô trùng tạo huyền phù tế bào không còn các hóa chất của môi trường nhân giống. Bổ sung 100ộl huyền phù tế bào này vào các ống nghiệm có chứa ựầy môi trường khảo sát sao cho mật ựộ tế bào ựạt 104 tế bào/ml. Sau 5 Ờ 7 ngày nuôi yếm khắ, chiếu sáng, sự tăng trưởng của các chủng của các chủng VKQH tắa ựược ựánh giá bằng cách xác ựịnh ựộ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 660nm Ờ OD660 trên máy ựo quang phổ.
- Xác ựịnh nhu cầu vitamin cần cho sự tăng trưởng của VKQH tắa: tạo từng hỗn hợp vitamin gồm 5 trong 6 loại vitamin sau: thiamin (1g/l), niacin (1g/l), p-aminobenzoic acid (0,6g/l), pyridoxal Ờ HCl (0,2 g/l), biotin (0,1 mg/l), vitamin B12 (0,1 mg/l). Các hỗn hợp này lần lượt ựược ký hiệu là: khuyết thiamin (-t), khuyết niacin (-n), khuyết p-aminobenzoic acid (-p), khuyết pyridoxal Ờ HCl (-HCl), khuyết biotin (-b), khuyết vitamin B12 (-B12). Bổ sung 50ộl từng hỗn hợp vitamin vào ống nghiệm chứa 25ml môi trường khảo sát. Chuẩn bị huyền phù tế bào giống, sạch vitamin bằng cách li tâm 1ml huyền phù tế bào của chủng khảo sát ở 8000 vòng/phút trong 3 phút ựể loại bỏ vitamin trong môi trường nhân giống. Rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng và ly tâm với ựiều kiện tương tự. Huyền phù hóa tế bào trong 1ml nước cất vô trùng. Bổ sung 50ộl huyền phù tế bào này vào mỗi ống nghiệm chứa 25ml môi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
trường khảo sát chứa hỗn hợp vitamin khuyết nêu trên. Nuôi trong ựiều kiện yếm khắ, chiếu sáng, sau 7 ngày quan sát sự tăng trưởng trong môi trường.
Nhu cầu vitamin ựược xác ựịnh như sau: tìm môi trường thiếu một vitamin nhất ựịnh mà chủng không tăng trưởng ựược, trong khi tăng trưởng ựược trên các môi trường khác có mặt vitamin ựó. Vitamin không hiện diện trong môi trường này chắnh là cần thiết cho sự tăng trưởng của chủng khảo sát.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sinh trưởng và phát triển của VKQH tắa: các chủng VKQH tắa ựược ựược nuôi cấy trong môi trường thắch hợp, trong các nhiệt ựộ khác nhau: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Sau 5 Ờ 7 ngày nuôi yếm khắ, chiếu sáng, sự tăng trưởng của các chủng của các chủng VKQH tắa ựược ựánh giá bằng cách xác ựịnh ựộ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 660nm Ờ OD660 trên máy ựo quang phổ.
3.3.2.3.Phương pháp xác ựịnh trình tự gen mã hóa rRNA 16S
Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo Sambrook
Các bước tiến hành:
- Dịch tế bào vi khuẩn ựang sinh trưởng ở pha log ựược ựưa vào ống eppendoff, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ựể loại bỏ dịch nuôị
- Hòa tan trở lại trong 400 ộl dịch thủy phân (10mM tris Ờ HCl, pH =8, 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 25% sacarozạ Trên 10 ộl lysozym 10mg/ml. Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 15 phút.
- Thêm 15 ộl protease 1mg/ml và tiếp tục ủ ở 560C trong 1h
- Thêm 450 ộl hỗn hợp phenol/chloroform có tỷ lệ 1:1, ựảo nhẹ ống. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt ựộ phòng. Lấy pipet hút nhẹ dung môi ở phắa trên sang một ống khác.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- Chiết lại bằng 450 ộl chloroform
- Thêm 0,1 V CH3COOK 3M, pH = 5,2. Thêm 2V cồn tuyệt ựối lạnh, ựặt ở 200C trong 3h.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ựộ 40C, loại bỏ phần dịch.
- Rửa lại bằng cồn 70%, tiếp tục li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ựộ 40C
- Cô chân không trong 5 phút - Hòa tan trong 40 ộl ựệm TE - Lấy 3 ộl kiểm tra ựiện di trên gel
Phản ứng PCR nhân ựoạn gen mã hoá rRNA 16S
Sử dụng cặp mồi 20F và 1500R ựể khuếch ựại ựoạn gen mã hóa cho phân tử rRNA 16S nguyên vẹn, (kắch thước khoảng 1500bp). Mỗi phản ứng PCR ựược thực hiện ở dung tắch 50 ộl với các thành phần sau: 1 ộl DNA mẫu, 1 ộl mồi 20F, 1 ộl mồi 1500R, 5M dung dịch ựệm 10X, 4 ộl dNTP, 0,5 ộl Ex Taq polymeras và 37.5 ộl nước cất vô trùng. Chù trình PCR: 1 chu kì 94oC trong 1 phút; 35 chu kì mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tắnh ở 96oC trong 30 giây, bắt cặp ở 55oC trong 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 2 phút; 1 chu kỳ 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR ủ ở 4oC cho ựến khi sử dụng.
Tinh sạch sản phẩm khuếch ựại
điện di 45 ộl sản phẩm PCR của phản ứng PCR I trên gel agarosẹ Thu nhận vạch khuếch ựại rRNA 16S từ gel agarose bằng bộ kit QIAEX II theo hướng dẫn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Giải trình tự các ựoạn ngắn thuộc rRNA 16S ựược khuếch ựại bằng phản ứng PCR II dựa vào phương pháp dideoxy nucleic acid ( Cycle sequencing by PCR method)
Các phân ựoạn khác nhau trong rRNA 16S ựược khuếch ựại dựa trên khuôn là DNA mạch ựơn của rRNA 16S (từ phản ứng PCR I) và giải trình tự bằng phản ứng PCR II với 6 mồi (20F, 520F, 920F, 520R, 920R, 1500R). Phản ứng PCR ựược thực hiện trong dung tắch 20 ộl gồm các thành phần: 1 ộl sản phẩm DNA của phản ứng PCR I, 1 ộl mồi, 8 ộl ABI PrimsTM Bigdye và 10 ộl nước cất vô trùng. Chương trình phản ứng PCR II: 1 chu kì 96oC trong 5 phút; 25 chu kì mỗi chu kì gồm 3 bước: biến tắnh ở 96oC trong 10 giây, bắt cặp ở 50oC trong 5 giây, kéo dài ở 60oC trong 47 phút; 1 chu kỳ 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCRII ủ ở 4oC cho ựến khi ựiện dị
điện di giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S
Sản phẩm PCRII ựược tinh sạch bằng phương pháp tủa DNA với sodium acetate 3mM trong ethanol lạnh 95Ẹ sau ựó dược huyền phù trong 15 ộl dung dịch Template Suppresion Reagent và ựược biến tắnh ở 96oC trong 2 phút trước khi ựược phân tắch bằng thiết bị giải trình tự tự ựộng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35