CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.3. Phương pháp đánh giá hiệu quả diệt khuẩn của vật liệu nano composite
Khả năng diệt vi khuẩn E.Coli ATCC 25922 và Coliform ATCC 35029
của vật liệu silica - Ag được tiến hành theo quy trình như sau:
2.5.3.1. Pha chế môi trường
Môi trường sử dụng cho mục đích nghiên cứu là môi trường đông khô được nhập khẩu trực tiếp từ hãng Merck.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
Cách pha chế như sau: Cân một lượng chính xác môi trường trên và cho vào bình tam giác vô trùng, bổ sung nước cất vô trùng. Đun tan bằng nồi cách thuỷở 100 - 1100C. Duy trì ở nhiệt độ 450C trước khi đưa vào quá trình phân tích.
2.5.3.2. Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
Chuẩn bị dung dịch E.Coli hoặc Coliforms 106CFU/ml bằng cách cho 10 ml E.Coli (hoặc Coliforms) 109CFU/ml lắc đều trong 10 lít nước cất. Dung dịch thu được cho chảy qua cột lọc được thiết kế sẵn với đường kính cột 4cm chứa 20g vật liệu Silica/Ag, điều chỉnh lưu lượng dòngchảy 3 l/h. Tiến hành lấy mẫu dung dịch tại đầu ra của cột lọc sau các khoảng thời gian 10 phút; 30 phút; 60 phút; 90 phút; 120 phút; 180 phút.
Tại mỗi khoảng thời gian hút 1 ml dung dịch thu được sau cột lọc bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch nước cất vô trùng. Dịch mẫu trong ống nghiệm được lắc đều bằng máy rung (vortex). Dung dịch mẫu này có độ pha loãng là 10-1. Sau đó sử dụng cùng pipetman có đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ 2 chứa dung dịch pha loãng và thao tác tương tựđể có dịch mẫu với độ pha loãng 10-2.
2.5.3.3. Cấy mẫu đã pha trên đĩa petri
Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp, dùng pipet vô trùng hoặc pipetman với đầu típ vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 3 đĩa. Sau khi cấy đổ vào mỗi đĩa 15ml môi trường đã được đun chảy và ổn định ở 450C.
Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Toàn bộ quy trình được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.3
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30
Hình 2.1. Quy trình đánh giá khả năng diệt khuẩn của vật liệu Silica/Ag
Dịch vi khuẩn 106 CFU/ml
Mẫu nước cần phân tích thu được
ở thời gian 10 phút; 30 phút; 60 phút; 90 phút; 120 phút; 180 phút.
Dãy pha loãng 10, 100….lần
Đĩa pertri Đĩa pertri mọc các khuẩn lạc. Nồng độ vi khuẩn Chảy qua cột lọc. Pha loãng - Hút 1ml vào đĩa pertri. - Thêm 15 ml môi trường
Ủở 370C trong 24 giờ
- Đếm số khuẩn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31
2.5.3.4. Tính toán kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có sốđếm từ 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau :
A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó:
A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.
V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi : độ pha loãng tương ứng.