huỳnh quang tại chỗ (FISH)
Sau khi nuôi cấy tế bào tủy xƣơng từ các mẫu nghiên cứu và tiến hành làm tiêu bản u tƣơi để thực hiện kĩ thuật FISH, các mẫu tế bào u và tủy xƣơng không có khuếch đại gen MYCN và có khuếch đại gen MYCN đƣợc xác định.
Tế bào u không có khuếch đại gen MYCN là tiêu bản mang 2 tín hiệu đỏ, số tín hiệu xanh từ 2-10 tín hiệu (Hình 3.1A).
Tế bào u có khuếch đại gen MYCN là tiêu bản mang 2 tín hiệu đỏ, số tín hiệu xanh quan sát đƣợc lớn hơn 10.Số lƣợng bản sao gen MYCN có thể lên đến hàng trăm tín hiệu trong 1 tế bào (Hình 3.1B).
Hình 3.1.Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u
Hình A. Tế bào u không có khuếch đại gen MYCN; Hình B. Tế bào u có khuếch đại gen MYCN.
Trong 54 mẫu bệnh phẩm u có 44 mẫu u không có khuếch đại gen MYCN và 10 mẫu u còn lại có khuếch đại gen MYCN.
27
Hình 3.2. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xương
Hình A. Tế bào tủy xương không có khuếch đại gen MYCN; Hình B. Tế bào tủy xương có khuếch đại gen MYCN.
Trong 5 mẫu tủy xƣơng có 4 mẫu tủy không có khuếch đại gen MYCN(Hình 3.2 A) và 1 mẫu tủy có khuếch đại gen MYCN ở dạng DMs (Hình 3.2 B).
Hình 3.3. Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs Hình A. Khuếch đại dạng HSR; Hình B. Khuếch đại dạng DMs
Khi tiến hành đánh giá kết quả trên kính hiển vi huỳnh quangphát hiện đƣợc đầy đủ 2 dạng khuếch đại là HSR ( Hình 3.3 A) và DMs (Hình 3.3 B).
28
Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một kĩ thuật di truyền tế bào dùng để phát hiện các bất thƣờng ở mức độ dƣới NST.Ƣu điểm của kĩ thuật này là cho kết quả nhanh (trong vòng từ 24-48 giờ), độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sử dụng đƣợc trên nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau (máu, tủy xƣơng, tế bào nuôi cấy, mảnh sinh thiết lạnh, khối u cố định trong nến). Đặc biệt trong một số trƣờng hợp kĩ thuật FISH còn phát hiện đƣợc bất thƣờng trên các mẫu bệnh phẩm có tỷ lệ tế bào rất nhỏ (dƣới 10%). Hiện nay với sự tiến bộ trong việc sản xuất đầu dò huỳnh quang, kĩ thuật FISH ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và đơn giản nhiều hơn so với trƣớc kia. Kĩ thuật FISH còn có thể đƣợc sử dụng trong một số xét nghiệm định lƣợng nhƣ xác định số tế bào bất thƣờng hay số lƣợng tín hiệu bất thƣờng trong một tế bào.
Tuy nhiên kĩ thuật FISH cũng có một số điểm hạn chế nhất định.Thứ nhất,do phải phân tích thủ công nên việc phân tích một số lƣợng lớn tế bào gặp nhiều khó khăn.Vì vậy kĩ thuật FISH không thể sử dụng để theo dõi điều trị cho bệnh nhân hoặc đánh giá tồn dƣ tối thiểu sau điều trị.Thứ hai, do chi phí sản xuất đầu dò còn cao nên giá thành cho một lần xét nghiệm là tốn kém hơn so với xét nghiệm khác.Thứ ba, vì dựa trên tín hiệu huỳnh quang để phát hiện bất thƣờng nên xét nghiệm FISH bị giới hạn về số lƣợng bất thƣờng cũng nhƣ số lƣợng mẫu trong một lần chạy.Cụ thể, hiện nay số lƣợng màu tối đa trong một đầu dò là 4 màu, tức là phát hiện đƣợc 3-4 bất thƣờng cùng lúc trên một mẫu bệnh phẩm. Điều này góp phần làm tăng giá thành của xét nghiệm này.
Bảng 3.1. Kết quả xác định gen MYCN trên bệnh nhân UNBTK
Mẫu bệnh phẩm
Không khuếch đại gen
MYCN
Khuếch đại gen
MYCN
Tổng số
U tƣơi 44 10 54
29
Hình 3.4. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK
Trong nghiên cứu này,có tổng số 59 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán mắc uNBTK đƣợc tiến hành kĩ thuật FISH xác định khuếch đại gen MYCN.Trong đó có 48bệnh
nhân đƣợc xác định không có khuếch đại gen MYCN, chiếm tỉ lệ 81%, có 11 bệnh
nhân xác định có khuếch đại gen MYCN, chiếm tỉ lệ 19% (xem danh sách ở Error! Reference source not found.).Nhƣ vậy tỷ lệ này tƣơng đƣơng với nghiên cứu
củaAdela Canete và cs năm 2009[11]và nghiên cứu của Vũ Đình Quang và cs năm 2013[2]. Vì vậy, kết quả này trong nghiên cứu của tôi là phù hợp với các kết quả trên thế giới và Việt Nam và có giá trị tin cậy.
Bảng 3.2. Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN
Bệnh nhân Tuổi Giới
Mô bệnh học (MBH) Giai đoạn Điều trị Trạng thái biệt hóa Phân loại MBH Bệnh nhân 1 13,1 Nam u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi L2
Không điều trị
Bệnh nhân 2 24,8 Nam u NBTK ít biệt hóa
Không
thuận lợi M A3691 Bệnh nhân 3 20,4 Nữ u NBTK ít Không M Không điều
30
Bệnh nhân Tuổi Giới Mô bệnh học (MBH) Giai đoạn
Điều trị
biệt hóa thuận lợi trị
Bệnh nhân 4 18 Nam u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Bỏ điều trị sau 1 đợt hóa chất Bệnh nhân 5 8,6 Nữ u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi M
Điều trị giảm nhẹ Bệnh nhân 6 26,8 Nữ u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 7 22,9 Nam u NBTK ít biệt hóa Không
thuận lợi L2 Tử vong Bệnh nhân 8 8,7 Nam u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi L2
Không có thông tin Bệnh nhân 9 34,6 Nữ u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 10 34,4 Nữ u NBTK không biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 11 12,5 Nữ u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi M
Không có thông tin
Hiện nay khuếch đại gen MYCN đƣợc chấp nhận trên phạm vi toàn thế giới là
một dấu ấn sinh học của các bệnh nhân u NBTK nguy cơ cao[22].Điều này có nghĩa là một bệnh nhân mang khuếch đại gen MYCN dù ở bất kì lứa tuổi hay giai đoạn nào đều có tiên lƣợng xấu và kết quả điều trị thấp.Khi đối chiếu với kết quả nghiên cứu của tôi, trong tổng số 59 bệnh nhân sẽ có 11 bệnh nhân đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao, cần điều trị hóa chất mạnh tối đa kết hợp thêm xạ trị,ghép tế bào gốc…
31