2.3.1 Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xương
23
nghiệm tiếp theo để đánh giá các bất thƣờng ở mức độ tế bào hoặc đột biến gen trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh.
Mẫu bệnh phẩm dịch tủy xƣơng sẽ đƣợc nuôi cấy với môi trƣờng RPMI và FBS trong vòng 24 giờ. Mỗi một mẫu bệnh phẩm đƣợc nuôi cấy theo 2 cách: nuôi cấy có bổ sung colcemid và nuôi cấy thƣờng, thêm colcemid trƣớc thời điểm thu hoạch 2 giờ. Sau đó, các mẫu nuôi cấy này sẽ đƣợc thu hoạch để thu thập các tế bào cũng nhƣ các cụm nhiễm sắc thể sau nuôi cấy phục vụ cho các xét nghiệm tiếp theo.
2.3.2 Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ
Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH - Florescence In Situ Hybridization) là một xét nghiệm quan trọng để phát hiện ra đột biến gen MYCN trên các bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh. Mẫu bệnh phẩm dùng cho phản ứng này là tiêu bản cắt lạnh u tƣơi, các tế bào tủy sau nuôi cấy.
Về nguyên lý, phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ là một phản ứng gắn các đầu dò (probe) huỳnh quang đặc hiệu lên vùng gen tƣơng ứng, nhằm phát hiện các đột biến của gen này (mất, chuyển đoạn hay khuếch đại gen). Chuỗi xoắn kép sẽ đƣợc tháo xoắn ở nhiệt độ cao, sau đó các đầu dò huỳnh quang sẽ đƣợc gắn đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung vào vùng gen đích. Sau đó các tiêu bản này sẽ đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang tại vùng gen đích. Dựa vào số lƣợng tín hiệu quan sát đƣợc, ta có thể xác định đƣợc gen đó có bị đột biến (mất, chuyển đoạn hay khuếch đại) hay không.
Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ cho bệnh u nguyên bào thần kinh đƣợc tiến hành để phát hiện sự khuếch đại gen MYCN. Đầu dò huỳnh quang đƣợc sử dụng là
Vysis LSI N-MYC (2p24) SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe, gồm có 2
màu đánh dấu vào 2 vùng khác nhau trên nhiễm sắc thể số 2. Màu xanh đánh dấu vào vùng 2p24, là vùng gen MYCN; màu đỏ đánh dấu vào tâm động nhiễm sắc thể số 2 đƣợc sử dụng nhƣ tín hiệu đối chứng nhƣ hình sau:
24
Hình 2.1. Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 (nguồn: công ty Vysis - Abbott)
Các tiêu bản sẽ đƣợc lai với đầu dò theo chu trình nhiệt xác định (75oC trong 4 phút và 37oC qua đêm) bằng máy lai ThermoBrite Statspin (Abbott). Sau đó tiêu bản lai huỳnh quang sẽ đƣợc nhuộm với DAPI (để nhuộm màu tế bào) và quan sát dƣới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang của Zeiss bằng phần mềm Metasystem Isis. Căn cứ vào số lƣợng từng tín hiệu quan sát đƣợc, ta sẽ đánh giá sự khuếch đại và số lƣợng bản sao gen MYCN. Thông thƣờng sẽ quan sát đƣợc 2 tín hiệu đỏ,
tƣợng trƣng cho 2 nhiễm sắc thể số 2. Số lƣợng tín hiệu xanh có thể là 2, 3, 4, 10 hay nhiều hơn nữa. Sự khuếch đại gen MYCN chỉ đƣợc ghi nhận khi số tín hiệu
xanh nhiều hơn 10 trong 1 tế bào.
2.4 Đạo đức trong nghiên cứu
Kết quả phân tích di truyền giúp các bác sĩ lâm sàng có thể phân giai đoạn bệnh chính xác, lựa chọn đƣợc phác đồ điều trị, có tiên lƣợng điều trị, tái phát một cách chính xác nhất cho bệnh nhân, từ đó giúp bệnh nhân đƣợc điều trị tốt nhất, giảm tối đa đau đớn và chi phí. Đồng thời kết quả nghiên cứu sẽ là bƣớc đầu trong việc xác định bản đồ di truyền cho các bệnh nhân nhi mắc u nguyên bào thần kinh ở Việt Nam.
25
Nghiên cứu đƣợc thông qua Hội đồng Y đức và Hội đồng Khoa học của Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng.
Bệnh nhân, hoặc gia đình hay ngƣời bảo trợ cho bệnh nhân sẽ đƣợc giải thích trƣớc khi đƣa vào nghiên cứu. Trong trƣờng hợp đồng ý, đối tƣợng sẽ đƣợc thu thập thông tin cần thiết, thu thập mẫu bệnh phẩm và ký vào bản cam kết thực hiện xét nghiệm với các điều khoản đã soạn thảo.
26
3 CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Xác định khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u NBTK bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) huỳnh quang tại chỗ (FISH)
Sau khi nuôi cấy tế bào tủy xƣơng từ các mẫu nghiên cứu và tiến hành làm tiêu bản u tƣơi để thực hiện kĩ thuật FISH, các mẫu tế bào u và tủy xƣơng không có khuếch đại gen MYCN và có khuếch đại gen MYCN đƣợc xác định.
Tế bào u không có khuếch đại gen MYCN là tiêu bản mang 2 tín hiệu đỏ, số tín hiệu xanh từ 2-10 tín hiệu (Hình 3.1A).
Tế bào u có khuếch đại gen MYCN là tiêu bản mang 2 tín hiệu đỏ, số tín hiệu xanh quan sát đƣợc lớn hơn 10.Số lƣợng bản sao gen MYCN có thể lên đến hàng trăm tín hiệu trong 1 tế bào (Hình 3.1B).
Hình 3.1.Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u
Hình A. Tế bào u không có khuếch đại gen MYCN; Hình B. Tế bào u có khuếch đại gen MYCN.
Trong 54 mẫu bệnh phẩm u có 44 mẫu u không có khuếch đại gen MYCN và 10 mẫu u còn lại có khuếch đại gen MYCN.
27
Hình 3.2. Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xương
Hình A. Tế bào tủy xương không có khuếch đại gen MYCN; Hình B. Tế bào tủy xương có khuếch đại gen MYCN.
Trong 5 mẫu tủy xƣơng có 4 mẫu tủy không có khuếch đại gen MYCN(Hình 3.2 A) và 1 mẫu tủy có khuếch đại gen MYCN ở dạng DMs (Hình 3.2 B).
Hình 3.3. Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs Hình A. Khuếch đại dạng HSR; Hình B. Khuếch đại dạng DMs
Khi tiến hành đánh giá kết quả trên kính hiển vi huỳnh quangphát hiện đƣợc đầy đủ 2 dạng khuếch đại là HSR ( Hình 3.3 A) và DMs (Hình 3.3 B).
28
Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một kĩ thuật di truyền tế bào dùng để phát hiện các bất thƣờng ở mức độ dƣới NST.Ƣu điểm của kĩ thuật này là cho kết quả nhanh (trong vòng từ 24-48 giờ), độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sử dụng đƣợc trên nhiều mẫu bệnh phẩm khác nhau (máu, tủy xƣơng, tế bào nuôi cấy, mảnh sinh thiết lạnh, khối u cố định trong nến). Đặc biệt trong một số trƣờng hợp kĩ thuật FISH còn phát hiện đƣợc bất thƣờng trên các mẫu bệnh phẩm có tỷ lệ tế bào rất nhỏ (dƣới 10%). Hiện nay với sự tiến bộ trong việc sản xuất đầu dò huỳnh quang, kĩ thuật FISH ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và đơn giản nhiều hơn so với trƣớc kia. Kĩ thuật FISH còn có thể đƣợc sử dụng trong một số xét nghiệm định lƣợng nhƣ xác định số tế bào bất thƣờng hay số lƣợng tín hiệu bất thƣờng trong một tế bào.
Tuy nhiên kĩ thuật FISH cũng có một số điểm hạn chế nhất định.Thứ nhất,do phải phân tích thủ công nên việc phân tích một số lƣợng lớn tế bào gặp nhiều khó khăn.Vì vậy kĩ thuật FISH không thể sử dụng để theo dõi điều trị cho bệnh nhân hoặc đánh giá tồn dƣ tối thiểu sau điều trị.Thứ hai, do chi phí sản xuất đầu dò còn cao nên giá thành cho một lần xét nghiệm là tốn kém hơn so với xét nghiệm khác.Thứ ba, vì dựa trên tín hiệu huỳnh quang để phát hiện bất thƣờng nên xét nghiệm FISH bị giới hạn về số lƣợng bất thƣờng cũng nhƣ số lƣợng mẫu trong một lần chạy.Cụ thể, hiện nay số lƣợng màu tối đa trong một đầu dò là 4 màu, tức là phát hiện đƣợc 3-4 bất thƣờng cùng lúc trên một mẫu bệnh phẩm. Điều này góp phần làm tăng giá thành của xét nghiệm này.
Bảng 3.1. Kết quả xác định gen MYCN trên bệnh nhân UNBTK
Mẫu bệnh phẩm
Không khuếch đại gen
MYCN
Khuếch đại gen
MYCN
Tổng số
U tƣơi 44 10 54
29
Hình 3.4. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK
Trong nghiên cứu này,có tổng số 59 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán mắc uNBTK đƣợc tiến hành kĩ thuật FISH xác định khuếch đại gen MYCN.Trong đó có 48bệnh
nhân đƣợc xác định không có khuếch đại gen MYCN, chiếm tỉ lệ 81%, có 11 bệnh
nhân xác định có khuếch đại gen MYCN, chiếm tỉ lệ 19% (xem danh sách ở Error! Reference source not found.).Nhƣ vậy tỷ lệ này tƣơng đƣơng với nghiên cứu
củaAdela Canete và cs năm 2009[11]và nghiên cứu của Vũ Đình Quang và cs năm 2013[2]. Vì vậy, kết quả này trong nghiên cứu của tôi là phù hợp với các kết quả trên thế giới và Việt Nam và có giá trị tin cậy.
Bảng 3.2. Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN
Bệnh nhân Tuổi Giới
Mô bệnh học (MBH) Giai đoạn Điều trị Trạng thái biệt hóa Phân loại MBH Bệnh nhân 1 13,1 Nam u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi L2
Không điều trị
Bệnh nhân 2 24,8 Nam u NBTK ít biệt hóa
Không
thuận lợi M A3691 Bệnh nhân 3 20,4 Nữ u NBTK ít Không M Không điều
30
Bệnh nhân Tuổi Giới Mô bệnh học (MBH) Giai đoạn
Điều trị
biệt hóa thuận lợi trị
Bệnh nhân 4 18 Nam u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Bỏ điều trị sau 1 đợt hóa chất Bệnh nhân 5 8,6 Nữ u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi M
Điều trị giảm nhẹ Bệnh nhân 6 26,8 Nữ u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 7 22,9 Nam u NBTK ít biệt hóa Không
thuận lợi L2 Tử vong Bệnh nhân 8 8,7 Nam u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi L2
Không có thông tin Bệnh nhân 9 34,6 Nữ u NBTK ít biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 10 34,4 Nữ u NBTK không biệt hóa Không thuận lợi L2 Không có thông tin Bệnh nhân 11 12,5 Nữ u NBTK ít
biệt hóa Thuận lợi M
Không có thông tin
Hiện nay khuếch đại gen MYCN đƣợc chấp nhận trên phạm vi toàn thế giới là
một dấu ấn sinh học của các bệnh nhân u NBTK nguy cơ cao[22].Điều này có nghĩa là một bệnh nhân mang khuếch đại gen MYCN dù ở bất kì lứa tuổi hay giai đoạn nào đều có tiên lƣợng xấu và kết quả điều trị thấp.Khi đối chiếu với kết quả nghiên cứu của tôi, trong tổng số 59 bệnh nhân sẽ có 11 bệnh nhân đƣợc xếp vào nhóm nguy cơ cao, cần điều trị hóa chất mạnh tối đa kết hợp thêm xạ trị,ghép tế bào gốc…
31
3.2 Đánh giá khuếch đại gen MYCN với một số yếu tố tiên lƣợng khác
3.2.1 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tuổi
Trong 11 bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN, có 2 bệnh nhân thuộc nhóm dƣới 12 tháng, 2 bệnh nhân trong nhóm từ 12-18 tháng, có 7 bệnh nhân trong nhóm lớn hơn 18 tháng
Bảng 3.3. Phân bố khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi Số lƣợng bệnh nhân Tỷ lệ
<12 tháng 2 18%
12-18 tháng 2 18%
>18 tháng 7 64%
Nhận xét: Tuổi chẩn đoán thấp nhất phát hiện khuếch đại gen MYCN: 8.7
tháng.Tuổi chẩn đoán cao nhất phát hiện khuếch đại gen MYCN: 34.4 tháng
Hình 3.5. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi Bảng 3.4. Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi Số lƣợng bệnh nhân Tỷ lệ
<12 tháng 21 44%
12-18háng 10 21%
32
Hình 3.6. Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi
Nhận xét: Nhóm tuổi chẩn đoán mắc UNBTK trên 18 tháng có tỷ lệ phát hiện khuếch đại gen MYCN cao nhất : 64%.Nhóm tuổi chẩn đoán mắc u NBTK dƣới 12
tháng và từ 12- 18 tháng có tỷ lệ khuếch đại gen MYCN thấp hơn : 18%.
Theo các công bố trên thế giới các bệnh nhân nhỏ , dƣới 12 tháng có tiên lƣợng bệnh tốt nhất.Điều này có nghĩa là các khối u sẽ có các đặc điểm sinh học thuận lợi trong đó gen tiền ung thƣ MYCN ít khuếch đại. Ngƣợc lại các bệnh nhân lớn (hơn 18 tháng) có tiên lƣợng bệnh kém hơn đồng nghĩa gen MYCN có xu hƣớng khuếch đại
nhiều hơn [16].
Cụ thể nhóm bệnh nhân có tuổi chẩn đoán hơn 18 tháng có tỷ lệ khuếch đại là 7 /11 bệnh nhân chiếm 64% tổng số bệnh nhân khuếch đại,còn với nhóm bệnh nhân ít hơn 12 tháng chỉ có 2 bệnh nhân khuếch đại.Kết quả này tƣơng đối khác biệt với nghiên cứu của Schmidt và cộng sự năm 2005 [33],Vũ Đình Quang và cộng sự (2015)[3].
Nhóm bệnh nhân từ 12-18 tháng thƣờng nằm trong giai đoạn 4S. Đây là nhóm bệnh nhân đặc biêt gồm các bệnh nhân giai đoạn 4 chỉ di căn đến một số cơ quan nhất định nhƣ da,xƣơng…Đặc biệt các bệnh nhân nhóm này mặc dù ở giai đoạn muộn nhƣng có khả năng tự thoái triển khối u.Do đó việc tiên lƣợng và kết quả điều trị của nhóm bệnh nhân này phụ thuộc rất nhiều vào đặc điểm sinh học của khối u mà ở đó khuếch đại gen MYCN là dấu ấn tiên lƣợng xấu hàng đầu.Hiện nay vẫn chƣa có một
33
Nghiên cứu này cho thấy rằng tỷ lệ khuếch đại gen MYCN từ 12-18 tháng là tƣơng
đƣơng với các bệnh nhân dƣới 12 tháng.Mặc dù vậy, để khẳng định phát hiện này cần có một nghiên cứu sâu hơn với kích thƣớc mẫu nhiều hơn.
3.2.2 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới tính
Hình 3.7. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới
Hình 3.8. Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới
Phân tích tỷ lệ khuếch đại gen MYCN cho thấytrên tổng số 11 bệnh nhân có
khuếch đại gen MYCN có 5 trẻ trai (45%) và 6 trẻ gái (55%).
U NBTK là một khối u của hệ thần kinh nên không có sự khác biệt về giới nhƣ các ung thứ khác(ung thƣ vú,ung thƣ tiền liệt tuyến…).Theo kết quả nghiên cứu của
34
tôi tỷ lệ khuếch đại gen MYCN ở giới nam là 5/11 bệnh nhân, giới nữ là 6/11 bệnh
nhân.Sự khác biệt về về giới này không có ý nghĩa thống kê.
3.2.3 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo mô bệnh học
3.2.3.1 Tỷ lệ khuếch đại genMYCN theo trạng thái biệt hóa
Kết quả khi so sánh các bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN với kết quả giải phẫu bệnh về trạng thái biệt hóa tế bào u của các bệnh nhân đƣợc thể hiện ở Error! Reference source not found. và Hình 3.7.
Bảng 3.5. Phân bố khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK
Trạng thái biệt hóa Số lƣợng Tỷ lệ
Chƣa biệt hóa 1 9%
Ít biệt hóa 9 82%
Đang biệt hóa 1 9%
35
Bảng 3.6. Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK
Trạng thái biệt hóa Số lƣợng Tỷ lệ
Chƣa biệt hóa 4 8%
Ít biệt hóa 40 83%
Đang biệt hóa 4 8%
Hình 3.10. Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u
Nhận xét: Số lƣợng bệnh nhân phát hiện khuếch đại gen MYCN cao nhất khi tế bào u ở trạng thái ít biệt hóa: 9 bệnh nhân (82%),tế bào ở trạng thái đang biệt hóa và chƣa biệt hóa tỷ lệ khuếch đại thấp nhất: 1 bệnh nhân (9%)
Trong quá trình phát triển bình thƣờng của tế bào thần kinh các nguyên bào thần kinh trải qua quá trình biệt hóa để hình thành nên các tế bào thần kinh trƣ ởng thành.Khi một nguyên bào thần kinh bị đột biến và tăng sinh không kiểm soát sẽ hình thành nên u NBTK,các tế bào này lại tiếp tục biệt hóa và phát triển, căn cứ vào số lƣợng các tế bào biệt hóa trong khối u ngƣời ta chia khối u NBTK thành 3 nhóm nhỏ:chƣa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa. Trong 3 nhóm này nhóm u NBTK ít biệt hóa chiếm tỷ lệ nhiều nhất khoảng 65%-75%.
Theo mô hình di truyền (Hình 1.4) của bệnh u NBTK các tế bào đã biệt hóa thƣờng chỉ có thay đổi về số lƣợng NST nên khả năng gặp khuếch đại gen MYCN ở
36
nhóm đang biệt hóa là thấp.Còn các tế bào u NBTK không biệt hóa sẽ có các biến đổi về cấu trúc NST cũng nhƣ khuếch đại gen MYCN.Các tế bào này sẽ tập trung ở nhóm u NBTK chƣa biệt hóa và ít biệt hóa.Giữa 2 nhóm này, nhóm ít biệt hóa chiếm đa số hơn 90%.Do vậy, dù khả năng khuếch đại gen MYCN ở các tế bào là tƣơng đƣơng
nhau nhƣng tỷ lệ phát hiện bất thƣờng này ở các bệnh nhân có khối u NBTK ít biệt hóa là cao hơn đáng kể.
Kết quả phát hiện khuếch đại MYCN ở 3 nhóm khác nhau trong u NBTK trong