Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ (FISH - Florescence In Situ Hybridization) là một xét nghiệm quan trọng để phát hiện ra đột biến gen MYCN trên các bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh. Mẫu bệnh phẩm dùng cho phản ứng này là tiêu bản cắt lạnh u tƣơi, các tế bào tủy sau nuôi cấy.
Về nguyên lý, phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ là một phản ứng gắn các đầu dò (probe) huỳnh quang đặc hiệu lên vùng gen tƣơng ứng, nhằm phát hiện các đột biến của gen này (mất, chuyển đoạn hay khuếch đại gen). Chuỗi xoắn kép sẽ đƣợc tháo xoắn ở nhiệt độ cao, sau đó các đầu dò huỳnh quang sẽ đƣợc gắn đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung vào vùng gen đích. Sau đó các tiêu bản này sẽ đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang tại vùng gen đích. Dựa vào số lƣợng tín hiệu quan sát đƣợc, ta có thể xác định đƣợc gen đó có bị đột biến (mất, chuyển đoạn hay khuếch đại) hay không.
Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ cho bệnh u nguyên bào thần kinh đƣợc tiến hành để phát hiện sự khuếch đại gen MYCN. Đầu dò huỳnh quang đƣợc sử dụng là
Vysis LSI N-MYC (2p24) SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe, gồm có 2
màu đánh dấu vào 2 vùng khác nhau trên nhiễm sắc thể số 2. Màu xanh đánh dấu vào vùng 2p24, là vùng gen MYCN; màu đỏ đánh dấu vào tâm động nhiễm sắc thể số 2 đƣợc sử dụng nhƣ tín hiệu đối chứng nhƣ hình sau:
24
Hình 2.1. Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 (nguồn: công ty Vysis - Abbott)
Các tiêu bản sẽ đƣợc lai với đầu dò theo chu trình nhiệt xác định (75oC trong 4 phút và 37oC qua đêm) bằng máy lai ThermoBrite Statspin (Abbott). Sau đó tiêu bản lai huỳnh quang sẽ đƣợc nhuộm với DAPI (để nhuộm màu tế bào) và quan sát dƣới hệ thống kính hiển vi huỳnh quang của Zeiss bằng phần mềm Metasystem Isis. Căn cứ vào số lƣợng từng tín hiệu quan sát đƣợc, ta sẽ đánh giá sự khuếch đại và số lƣợng bản sao gen MYCN. Thông thƣờng sẽ quan sát đƣợc 2 tín hiệu đỏ,
tƣợng trƣng cho 2 nhiễm sắc thể số 2. Số lƣợng tín hiệu xanh có thể là 2, 3, 4, 10 hay nhiều hơn nữa. Sự khuếch đại gen MYCN chỉ đƣợc ghi nhận khi số tín hiệu
xanh nhiều hơn 10 trong 1 tế bào.