Lựa chọn động vật thực nghiệm
Cơ chế bệnh sinh chủ yếu của XVĐM là sự lắng đọng và duy trì của cholesterol trong thành động mạch. Giảm mức cholesterol đã đƣợc chứng minh một cách rõ ràng giúp làm giảm các biến cố tim mạch và ngăn ngừa sự phát triển của XVĐM [92].Vì vậy, để đánh giá toàn diện tác dụng điều chỉnh RLLPM của một thuốc trên thực nghiệm, ngoài việc đánh giá hiệu quả trong việc làm giảm nồng độ cholesterol máu, khả năng làm giảm và ngăn ngừa sự phát triển của mảng xơ vữa cũng là một phần không thể thiếu. Lựa chọn động vật nghiên cứu trong mô hình gây XVĐM cần đƣợc xem xét sao cho gây đƣợc mô hình gần giống nhất với đặc điểm bệnh lý trên ngƣời, đồng thời phải gây đƣợc mô hình trong khoảng thời gian nghiên cứu hợp lý. Chuột không phải là động vật lý tƣởng để gây mô hình XVĐM vì khả
năng kháng lại sự hình thành mảng xơ vữa do không có cholesterol ester transfer protein (CETP)[72].Thỏ là loài động vật khá thích hợp để gây mô hình nghiên cứu vể rối loạn chuyển hóa lipoprptein bởi vì chúng có một số đặc điểm về chuyển hóa lipoprotein tƣơng tự ở ngƣời: thành phần các chứa apoB, khả năng sản xuất VLDL chứa apoB-100 của gan, hoạt động của CETP huyết tƣơng và khả năng hấp thu tốt cholesterol trong thức ăn, do vậy, khả năng hình thành mảng xơ vữa ở thỏ nhanh hơn ở chuột rất nhiều. Tuy nhiên, tình trạng RLLPM và tổn thƣơng xơ vữa ở thỏ không hoàn toàn tƣơng tự trên ngƣời. Thỏ có sự thiếu hụt hoạt động của enzym hepatic lipase, vì vậy có thể có hiện tƣợng tăng cả nồng độ HDL-C khi gây RLLPM trên thỏ [80]. Điều này có thể quan sát thấy trong nghiên cứu này từ số liệu từ các
Bảng 3.6 và Biểu đồ 3.3 với mức tăng rõ rệt nồng độ HDL-C ở các lô uống dầu cholesterol (lô 2, 4, 5) so với lô chứng sinh học (lô 1), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p ≤ 0,001. Thành phần tế bào trong mảng xơ vữa trên thỏ giàu acid béo và đại thực bào hơn so với mảng xơ vữa trên ngƣời.Tổn thƣơng xơ vữa của thỏ chủ yếu hình thành ở quai ĐMC và ĐMC ngực, không giống với vị trí hay gặp XVĐM nhất ở ngƣời là ĐMC bụng [80]. Đây cũng là lý do trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá tình trạng XVĐM dựa vào hình thái mô bệnh học ĐMC đoạn ngay trƣớc khi đổ vào động mạch vành của thỏ.
Kết quả nghiên cứu
Sau 4 tuần nghiên cứu, lô thỏ uống atorvastatin liều 5 mg/kg thể hiện tác dụng hạ lipid máu rõ rệt so với lô mô hình: nồng độ TC, LDL-C giảm so với lô mô hình (p < 0,001), nồng độ TG có xu hƣớng giảm so với lô mô hình (p > 0,05). Các lô uống SAD ở cả hai mức liều đều làm tăng nồng độ HDL-C so với lô mô hình (p < 0,001) nhƣng chƣa có sự cải thiện các chỉ số TC,TG, LDL-C so với lô mô hình (p > 0,05).
Sau 8 tuần nghiên cứu, kết quả ở Biểu đồ 3.3 cho thấy một lần nữa tác dụng hạ lipid máu khá tốt của SAD ở cả hai mức liều trên mô hình gây XVĐM: làm giảm rõ rệt nồng độ TC và LDL-C so với lô mô hình (p<0,001), không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hiệu quả điều trị ở 2 lô uống SAD. Nồng độ TG có xu hƣớng
giảm, riêng ở lô chuột uống SAD liều 0,54g cao khô/kg/ngày giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p<0,05).
Tác dụng điều chỉnh RLLPM của SAD còn đƣợc thể hiện một phần thông qua đánh giá hình ảnh vi thể và đại thể gan thỏ. Gan nhiễm mỡ là tình trạng tích lũy mỡ trong các tế bào gan. RLLPM là một trong những nguyên nhân hay gặp gây nên tình trạng thoái hóa mỡ của gan [62]. Vì vậy, đánh giá tình trạng gan nhiễm mỡ thông qua hình ảnh mô bệnh học của gan cũng góp phần đánh giá hiệu quả điều trị RLLPM của SAD. Từ kết quả nghiên cứu thể hiện ở Bảng 3.9 có thể thấy mức độ thoái hóa mỡ của gan ở các lô uống atorvastatin và SAD cả hai mức liều giảm hơn so với lô mô hình. Nhƣ vậy, chế phẩm SAD có tác dụng điều chỉnh RLLPM khá tốt, đồng thời cải thiện đƣợc tình trạng thoái hóa mỡ của gan.
Tác dụng của SAD đối với các thành phần lipid máu ở thỏ qua kết quả nghiên cứu đã tƣơng đối rõ nhƣng vẫn chỉ là những bằng chứng gián tiếp đối với XVĐM. Để khẳng định tác dụng giảm XVĐM của SAD, chúng tôi đã khảo sát về hình thái mô bệnh học ĐMC của 5 nhóm thỏ nghiên cứu. Hình ảnh đại thể và vi thể ĐMC của thỏ đã cho thấy rõ hiệu quả chống XVĐM của atorvastatin và SAD: 5/5 mẫu bệnh phẩm của lô uống atorvastatin 5 mg/kg/ngày, 5/5 mẫu bệnh phẩm của lô uống SAD 0,18g cao khô/kg/ngày,và 5/5 mẫu bệnh phẩm của lô uống SAD 0,54g cao khô/kg/ngày có hình ảnh cấu trúc vi thể bình thƣờng (Bảng 3.9).
Statin đã đƣợc chứng minh có tác dụng ngăn ngừa sự hình thành và ổn định mảng xơ vữa với một số cơ chế rõ ràng: cơ chế chống viêm với cải thiện chức năng nội mạc mạch làm tăng giải phóng NO, giảm sự kết dính bạch cầu, ức chế giải phóng CRP (C-reactive protein, protein phản ứng C); cơ chế chống oxy hóa với ức chế hoạt động của NAD(P)H oxidase, giảm sự hình thành của các superoxid, đồng thời giảm sự hình thành các LDL bị oxy hóa; một số cơ chế khác nhƣ tăng tổng hợp collagen, ức chế sự giải phóng các metalloproteinase – enzym tiêu protein – bởi các đại thực bào đƣợc hoạt hóa... [86]. Giảo cổ lam và chóc máu cũng đƣợc chứng minh có tác dụng chống viêm và/hoặc chống oxy hóa, do vậy đây cũng có thể những cơ chế chủ yếu chống XVĐM của chế phẩm:
- Gynostemma pentaphyllum thể hiện đặc tính chống viêm nổi trội trên nghiệm
pháp Carragenan gây phù chân chuột cống [87]
- Gynostemma pentaphyllum giúp hồi phục sự giảm bớt số lƣợng bạch cầu, AST, ALT, IgG trong huyết thanh chuột sau khi bị chiếu tia gamma. Do đó dƣợc liệu có tác dụng bảo vệ chuột tránh khỏi sự tác động của tia bức xạ [30].
- Maz.,Yang Z.đã nghiên cứu khả năng thu dọn gốc anion superoxide O2- và .OH của Gynostemma pentaphyllum bằng phƣơng pháp điện hóa cho kết quả khá tốt [57].
- Các gypenosid là saponin của Gynostemma pentaphyllum có tác dụng nhƣ
một chất chống oxy hóa đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều mô hình khác nhau thể hiện tác dụng chống oxy hóa lên đại thực bào, microsom gan và tế bào biểu mô nội mạch. Gypenosid làm giảm các anion superoxid và hydrogen peroxyd có chứa trong bạch cầu trung tính và làm giảm sự bùng nổ oxy hóa đƣợc khởi phát bởi zymosan chứa trong các bạch cầu đơn nhân và trong đại thực bào. Sự tăng quá trình peroxyd hóa lipid đƣợc khởi phát bởi Fe2+/cysteine, ascobat/NADPH hoặc hydrogen peroxyd trong các microsom gan và các tế bào biểu mô nội mạch bị ức chế bởi các gypenoside. Các gypenosid bảo vệ các màng sinh học khỏi tổn thƣơng oxy hóa bằng cách làm đảo ngƣợc sự giảm chất lỏng màng của microsom gan và ty nạp thể (mitochondria), tăng hoạt tính enzym của ty nạp thể trong các tế bảo biểu mô nội mạch và giảm sự thất thoát của enzym lactate dehydrogenase nội bào từ các tế bào này. Hiệu quả chống oxy hóa rõ rệt của các gypenosid có thể rất có giá trị trong điều trị và phòng ngừa xơ vữa động mạch [87].
- Kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong rễ cây chóc máu có flavonoid, anthranoid, saponin, tanin và acid hữu cơ, trong đó saponin, polyphenol (flavonoid, tanin) là thành phần chính cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào [29].
Thay đổi nồng độ AST, ALT
Chất ức chế mạnh HMG-CoA reductase của gan, nhóm statin, đƣợc xem là có vai trò trung tâm trong điều trị tăng cholesterol máu. Statin đã đƣợc chứng minh là
nhóm thuốc điều trị có hiệu quả nhất giúp làm giảm đáng kể nồng độ LDL-C, và có các tác dụng có lợi khác ngoài tác dụng lên nồng độ LDL-C [86]. Bên cạnh lợi ích, những tác dụng không mong muốn của statin khi sử dụng kéo dài cũng rất đƣợc quan tâm. Một trong những tác dụng không mong muốn hay gặp khi dùng statin dài ngày là tình trạng tăng hoạt độ transaminase gan. Những nghiên cứu ban đầu về sử dụng statin cho thấy xuất hiện tình trạng tăng transaminase gan cao gấp 3 lần giới hạn trên của mức bình thƣờng với tỷ lệ khoảng 1% [55]. Tình trạng tăng transaminase thƣờng không có triệu chứng và xuất hiện thoáng qua trong 12 tuần đầu điều trị. Cơ chế gây ra tác dụng không mong muốn này vẫn chƣa rõ ràng, có giả thiết cho rằng sử dụng statin có thể làm thay đổi các thành phần lipid của màng tế bào gan, làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự “rò rỉ” của các enzym gan [112]. Do đó, cần thiết phải định lƣợng hoạt độ các transaminase gan trƣớc và trong quá trình điều trị với statin [55]. Từ số liệu ở bảng 3.7 và bảng 3.8 cho thấy, ngay sau 4 tuần uống thuốc, hoạt độ AST và ALT huyết thanh thỏ uống atorvastatin 5 mg/kg đã tăng cao rõ rệt so với các lô còn lại trong nghiên cứu và so với trƣớc nghiên cứu. Mức độ tăng hoạt độ các transaminase gan có xu hƣớng tăng tỷ lệ thuận với thời gian uống atorvastatin. Kết quả nghiên cứu này đã cho thấy rõ tác dụng không mong muốn khi sử dụng statin kéo dài để điều trị RLLPM. Đây chính là một trong các lý do khiến các thuốc có nguồn gốc tự nhiên, vừa mang lại hiệu quả điều trị vừa hạn chế đƣợc các tác dụng không mong muốn cho ngƣời bệnh ngày càng đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển [113]. Số liệu trong nghiên cứu này đã cho thấy, cả 2 lô uống SAD đều không làm thay đổi hoạt độ transaminase gan có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học sau 8 tuần nghiên cứu. Nhƣ vậy, sử dụng SAD hạn chế đƣợc tác dụng không mong muốn trên gan khi sử dụng kéo dài. Một số nghiên cứu đã đƣợc thực hiện cho thấy, bên cạnh tác dụng hạ lipid máu, hai dƣợc liệu trong chế phẩm còn thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên các mô hình thực nghiệm.
- Saponin chiết xuất từ giảo cổ lam đƣợc chứng minh có tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa trên mô hình gây độc tế bào gan chuột bằng paracetamol. Thử nghiệm cho thấy saponin giảo cổ lam liều 200 mg/kg và 600 mg/kg có tác dụng hạn chế tổn thƣơng gan thông qua hạn chế tăng trọng lƣợng gan tƣơng đối và hoạt độ
AST, ALT, giảm nồng độ MDA trong dịch đồng thể gan, hạn chế tổn thƣơng trên vi phẫu gan [30].
- Các gypenosid chiết xuất từ G. pentaphyllum có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của CCl4. Và nghiên cứu cũng chỉ ra gypenosid có tác dụng bảo vệ tế bào gan, ức chế dòng tế bào Huh-7, Hep 3B và HA22T phát triển [114].
- Gypenosid với liều 50 mg/kg tiêm dƣới da và theo dõi trong 6 ngày hạn chế tác động của CCl4 lên γ-glutamin transaminase ở chuột cống thí nghiệm. Gypenosid có tác dụng kích thich phục hồi gan sau khi cắt bỏ một phần. Sử dụng cao thu đƣợc từ dịch chiết nƣớc G. pentaphyllum với liều 100, 300, 500 mg/kg làm tăng sự phục hồi gan bằng việc giảm hoại tử, xung huyết, sự thâm nhiễm của tế bào lympho và của tế bào Kupffer qua tĩnh mạch trung tâm của gan [87].
- Bằng phƣơng pháp sắc ký cột cặn dịch chiết n-hexan (6,81 g) trên cột silicagel với dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/ethyl acetate theo tỷ lệ tăng dần lƣợng ethyl acetate (0-100%), Trần Thị Minh và Cs đã phân lập và nhận dạng đƣợc 3 chất triterpen từ cặn dịch chiết n-hexan của Salacia là: 29-nor-21- H-hopan-3,22- dion; 21-H-hop-22(29)-en-3,30-diol; và 20(29)-lupen-3,28-diol, có tên là Betulin. Nghiên cứu cho thấy Betulin có tác dụng bảo vệ gan và làm giảm khả năng gây độc của CdCl2 ở nồng độ thấp 0,1 g/ml. Cơ chế có thể là do Betulin thúc đẩy sự tổng hợp các protein có tác dụng bảo vệ các tế bào gan khỏi ảnh hƣởng của CdCl2. Đây là lần đầu tiên 3 triterpen khung hopan và lupan đƣợc phân lập từ loài cây này [29].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút ra các kết luận nhƣ sau về chế phẩm SAD
Tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của SAD trên động vật thực nghiệm
Trên mô hình gây RLLPM nội sinh
SAD liều 0,72g cao khô/kg/ngày, 2,16 g cao khô/kg/ngày trên chuột nhắt trắng có tác dụng làm hạn chế sự rối loạn lipid gây ra do tiêm màng bụng Poloxamer 407: làm hạn chế sự tăng TC (giảm 13,56%, 14,49%), non HDL-C (giảm 16,40%, 11,10% ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên mô hình gây RLLPM ngoại sinh
Sau 4 tuần, SAD liều 0,36 g cao khô/kg/ngày có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên mô hình ngoại sinh ở chuột cống trắng có ý nghĩa thống kê (TG giảm 11,50%, TC giảm 19,8%, LDL-c giảm 32,95%). SAD với mức liều 1,08g/kg/ngày làm giảm TG có ý nghĩa thống kê ( giảm 12,28%),
Tác dụng chống xơ vữa động mạch của chế phẩm SAD trên động vật thực nghiệm
SAD liều 0,18g cao khô/kg/ngày và 0,54g cao khô/kg/ngày trên thỏ có tác dụng chống xơ vữa động mạch gây ra bởi dầu cholesterol, thể hiện bằng sự giảm các chỉ số lipid máu (TG, TC, LDL-C) và sự cải thiện hình ảnh mô bệnh học của quai ĐMC và gan thỏ so với lô mô hình.
5.1. Kiến nghị
Khi xã hội ngày càng phát triển, bệnh lý liên quan tới rối loạn lipid máu càng trở nên phổ biến. Nhu cầu tìm ra và sử dụng các phƣơng thuốc mới có hiệu quả, an toàn, giá thành hợp lý để điều trị rối loạn lipid máu là rất cấp thiết. Trong nghiên cứu của chúng tôi bƣớc đầu đã chứng minh chế phẩm SAD có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu trên chuột cống trắng và trên chuột nhắt trắng, đồng thời có tác dụng ngăn ngừa sự hình thành và phát triển của xơ vữa động mạch trên thỏ thực nghiệm. Với mong muốn chế phẩm SAD đƣợc sử dụng vào thực tiễn, chúng tôi kiến nghị đƣợc tiếp tục nghiên cứu về:
- Đánh giá sâu hơn về tác dụng điều chỉnh RLLPM ở nhiều loài động vật khác nhau trên thực nghiệm và kéo dài thời gian nghiên cứu hơn.
- Kết quả nghiên cứu thực nghiệm về tác dụng, độc tính cấp, và độc tính bán trƣờng diễn cho thấy: SAD không chỉ có tác dụng hạ glucose máu, điều chỉnh rối loạn lipid máu mà còn có tác dụng chống xơ vữa động mạch, và chƣa có biểu hiện độc tính cấp và bán trƣờng diễn. Để góp phần sớm đƣa SAD vào phục vụ sức khỏe cộng đồng cần làm các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân rối loạn lipid máu để đánh giá hiệu quả điều trị, độ an toàn của chế phẩm SAD.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Nhƣ Ái (2007), “Nghiên cứu tác dụng của gylopsin trên một số
chỉ số lipid và hàm lượng malonyl dialdehyd huyết tương ở thỏ uống cholesterol thực nghiệm”, Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y Hà Nội.
2. Phạm Tuấn Anh (2008), “Nghiên cứu cây giảo cổ lam thu hái tại Sa Pa, tỉnh
Lào Cai”, Luận văn thạc sỹ dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội
3. Bộ môn Hoá sinh (2001), “Chuyển hoá lipid”, Hoá sinh học, Nhà xuất bản Y
học Hà Nội, tr. 318 – 375.
4. Võ Văn Chi(1977), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, 308-309
5. Nguyễn Trung Chính, Trần Đình Toán (2000), “Tăng cholesterol máu bệnh
thời đại”, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, tr 50 – 70.
6. Nguyễn Tiến Dẫn (1999), “Nghiên cứu về thực vật, hóa học và một số tác
dụng sinh học của cây Gynostemma pentaphyllum”, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Đại học Dƣợc Hà Nội
7. Trịnh Thị Điệp, Trần Thanh Hà và cộng sự (2010), Thành phần hóa học của