Nghiên cứu của Nguyễn Trọng Thông và Cs (2014) về tác dụng hạ glucose máu của chế phẩm SAD trên động vật thực nghiệm và Đỗ Thị Thu Hƣớng (2014) [17], [43], nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu của chế phẩm SAD trên mô hình gây đái tháo đƣờng typ2 ở động vật thực nghiệm. Kết quả cho thấy:
- Trên chuột nhắt trắng gây ĐTĐ dạng typ 1, SAD liều 750 mg/kg cân nặng/ngày và liều 3750 mg/kg cân nặng/ngày uống liên tục 1 tuần không làm thay đổi nồng độ glucose máu trên chuột nhắt trắng gây ĐTĐ dạng typ 1 bằng alloxan liều 250 mg/kg.
- Trên chuột nhắt trắng đƣợc gây ĐTĐ dạng typ 2
SAD cả 2 liều 750 mg/kg cân nặng/ngày và 3750 mg/kg/ngày uống liên tục trong 2 tuần làm giảm rõ nồng độ glucose máu trên chuột nhắt trắng ĐTĐ dạng typ 2 so với thời điểm trƣớc uống thuốc và giảm rõ rệt so với lô mô hình (p < 0,05).
Tác dụng hạ glucose máu của SAD ở cả 2 liều 750 mg/kg/ ngày và 3750 mg/kg/ngày không có sự khác biệt khi so sánh với nhau (p > 0,05) và khi so sánh với gliclazid liều 80mg/kg /ngày (p > 0,05).
- Ngoài ra, kết quả nghiên cứu còn cho thấy bên cạnh tác dụng hạ glucose máu SAD còn có tác dụng hạ lipid máu rõ rệt. SAD ở cả 2 liều 750
mg/kg/ngày và liều 3750 mg/kg/ngày uống liên tục trong 2 tuần đều có tác dụng làm giảm rõ nồng độ cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL-C của chuột nhắt trắng ĐTĐ dạng typ 2 có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05).
Qua kết quả trên cho thấy SAD vừa có tác dụng hạ glucose máu vừa có tác dụng hạ lipid máu, một rối loạn chuyển hóa kép thƣờng gặp trên lâm sàng. Tuy nhiên, để trả lời câu hỏi liệu SAD thật sự có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid hay không, cần phải tiến hành nghiên cứu trên các mô hình chuyên về đánh giá tác dụng trên lipid. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và giảm xơ vữa động mạch của chế phẩm SAD trên động vật thực nghiệm” là cần thiết.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1. Chất liệu nghiên cứu
SAD do công ty TNHH Tuệ Linh cung cấp, SAD là sự kết hợp giữa:
Cao khô giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (thunb.) Makino cucurbitaceae)
và cao khô rễ chóc máu (Salacia cochichinensis Lour., Celastraceae) theo tỷ lệ 1:1. Giảo cổ lam và rễ chóc máu đƣợc chiết nóng, dung môi nƣớc, sau đó phun sấy tần sôi. Trong nghiên cứu này, SAD đƣợc cho động vật thử nghiệm uống nên trƣớc khi uống, thuốc thử đƣợc pha trong dung môi là nƣớc tao thành hỗn dịch với tỷ lệ thích hợp tùy nghiên cứu.
Cao khô giảo cổ lam và cao khô rễ chóc máu: Theo tiêu chuẩn cơ sở (phụ lục 1 và phụ lục 2).
3.1.2. Hoá chất và dụng cụ xét nghiệm
3.1.2.1. Hoá chất phục vụ nghiên cứu
- Cholesterol tinh khiết (Merck – Đức) - Dầu lạc (công ty Trƣờng An – Việt Nam)
- Propylthiouracil viên nén 50 mg (biệt dƣợc Lothisil ® - Young IL Pharma Hàn Quốc SĐK: VN-11252-10
- Acid cholic (Sigma – Singapore) - Poloxamer 407 (Sigma – Singapore)
- Atorvastatin viên nén 20 mg (Dƣợc phẩm Hậu Giang) SĐK: VD- 18910-13
- Kit định lƣợng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat
aminotransferase) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo).
- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
3.1.2.2. Máy móc phục vụ nghiên cứu
Máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).
3.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Động vật thực nghiệm đƣợc nuôi 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn riêng cho từng loại tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
Nơi cung cấp thức ăn: Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN và Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng.
Cụ thể:
Bảng 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu Động vật thực
nghiệm Tiêu chuẩn
Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình gây RLLPM ngoại sinh
Chuột cống trắng chủng Wistar
Khoẻ mạnh, trọng lƣợng từ 200-300g Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên
mô hình gây RLLPM nội sinh
Chuột nhắt trắng chủng Swiss Giống đực, khoẻ mạnh, trọng lƣợng 25±2g Tác dụng giảm VXĐM Thỏ chủng Newzealand White Khoẻ mạnh, trọng lƣợng 1,8-2,5kg
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu
+ Các nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu, giảm xơ vữa mạch máu đều đƣợc tiến hành tại Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
+ Các xét nghiệm sinh hoá, định lƣợng các chất trong các nghiên cứu trên đều đƣợc thực hiện tại phòng xét nghiệm, Bộ môn Dƣợc lý – Đại học Y Hà Nội.
+ Các xét nghiệm đánh giá tổn thƣơng giải phẫu bệnh động mạch chủ và gan đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thƣ – Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết quả).
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/ 2014 đến tháng 7/ 2015.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
3.4.1. Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của chế phẩm
Theo thông tin của nhà sản xuất, liều dùng SAD ở ngƣời là 6 viên/ngày tƣơng đƣơng 3g cao/ngày.
- Ngoại suy liều trên chuột nhắt (hệ số 12)
Dựa trên phƣơng pháp tính liều ngoại suy để tính liều cho động vật thực nghiệm trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng liều tƣơng đƣơng với liều dùng trên ngƣời là 0,72 g cao khô/kg/ngày.
Chế phẩm SAD Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh RLLPM Nghiên cứu tác dụng hạn chế VXĐM
Mô hình gây rối loạn lipid máu
ngoại sinh
Mô hình gây rối loạn lipid máu nội
Vì vậy, nghiên cứu trên chuột nhắt trắng sử dụng 2 mức liều là 0,72 g cao khô /kg/ngày và liều gấp 3 lần trên lâm sàng là 2,16 g cao khô /kg/ngày.
- Ngoại suy liều ở chuột cống (hệ số 6)
Chuột cống liều tƣơng đƣơng trên lâm sàng là 0,36 g cao khô/ kg /ngày. Liều cao gấp 3 trên lâm sàng là 1,08 g cao khô/ kg/ ngày
- Ngoại suy liều ở thỏ (hệ số 3)
Trên thỏ liều tƣơng đƣơng trên lâm sàng là 0,18 g cao khô/ kg/ngày. Liều cao gấp 3 trên lâm sàng là 0,54 g cao khô/ kg /ngày.
3.4.1.1. Mô hình gây rối loạn lipid máu ngoại sinh
Mô hình gây rối loạn lipid máu ngoại sinh đƣợc thực hiện bằng cách cho chuột cống trắng uống hỗn hợp dầu chứa cholesterol (trong 1ml hỗn hợp dầu cholesterol chứa: 0,1g cholesterol, 0,01g acid cholic và 0,005g propylthiouracil) với liều 10 ml/kg (1 ml/100g) cân nặng mỗi ngày vào buổi sáng, trong suốt 4 tuần liên tục (28 ngày) để gây tăng RLLPM.
Chuẩn bị hỗn hợp dầu cholesterol
- Cân 50g cholesterol
- Đun nóng cách thuỷ 200 ml dầu lạc, cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết, để nguội, cho thêm 5g acid cholic và 2,5g propylthiouracil, cuối cùng cho thêm dầu lạc vừa đủ 500ml
- Trong 1ml hỗn hợp dầu cholesterol chứa: 0,1g cholesterol, 0,01g acid cholic và 0,005g propylthiouracil.
Bổ sung acid cholic và PTU là một biện pháp để làm tăng hấp thu cholesterol và làm giảm chuyển hoá cholesterol thành acid mật, vì vậy gây đƣợc mô hình có độ ổn định, độ đồng nhất cao hơn và rút ngắn thời gian nghiên cứu (Bảng 2.2)
Theo nghiên cứu của Nguyễn Phƣơng Thanh để gây mô hình RLLPM ngoại sinh trên chuột cống trắng với mục đích vẫn gây đƣợc mô hình để đánh giá tác dụng cùa thuốc, nhƣng hạn chế đƣợc số lƣợng acid cholic phải sử dụng vì giá thành còn tƣơng đối cao [40].
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp dầu cholesterol
Thành phần Mô hình Nassiri (2009) Mô hình đã điều chỉnh
Cholesterol (g/ml) 0,1 0,1
Acid cholic (g/ml) 0,1 0,01
PTU (g/ml) 0,03 0,005
Dầu lạc vừa đủ 1 ml 1 ml
Chuột cống đƣợc chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, các lô đƣợc uống thuốc trong 4 tuần nhƣ sau:
- Lô 1 (lô chứng sinh học, n=10): Hàng ngày chuột chỉ uống nƣớc cất với cùng thể tích nhóm uống thuốc.
- Lô 2 (lô mô hình, n=10): Hàng ngày chuột đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol 1ml/100g chuột, sau đó 2 giờ cho uống nƣớc cất 1ml/100g chuột.
- Lô 3 (lô chứng dƣơng uống atorvastatin, n=10): Hàng ngày chuột đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol 1 ml/100g chuột, sau đó 2 giờ cho uống atorvastatin 10 mg/kg chuột.
- Lô 4 (lô uống thuốc thử liều tƣơng đƣơng trên lâm sàng, n=10): Hàng ngày chuột đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol 1 ml/100g chuột, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử với liều tƣơng đƣơng trên ngƣời (hệ số 6) là 0,36 g cao khô/kg/ngày.
- Lô 5 (lô uống thuốc thử liều gấp 3 lần trên lâm sàng, n=10): Hàng ngày chuột đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol 1 ml/100g chuột, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử với liều gấp 3 lâm sàng 1,08g cao khô/kg/ngày.
Tiến hành cân kiểm tra trọng lƣợng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trƣớc, sau thí nghiệm 1, 2 và 4 tuần.
Vào ngày đầu tiên, ngày thứ 15 (sau 2 tuần) và ngày thứ 29 (sau 4 tuần) của thí nghiệm, chuột trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Lấy máu đuôi của chuột và tiến hành định lƣợng cholesterol toàn phần (TC), TG, HDL-C, LDL-C.
LDL-C = TC – (HDL-C) – (TG/2,2) (mmol/L) Nƣớc + nƣớc Lô 1 (n = 10) Tuần 0 2 4 Dầu cholesterol + nƣớc Lô 2 (n = 10) Tuần 0 2 4
Dầu cholesterol + Atorvastatin 10mg/kg/ngày Lô 3 (n = 10) Tuần 0 2 4 Dầu cholesterol + SAD 0,36 g cao/kg chuột/ngày Lô 4 (n = 10) Tuần 0 2 4 Dầu cholesterol + SAD 1,08g cao/kg chuột/ngày Lô 5 (n = 10) Tuần 0 2 4
Chú thích: : Lấy máu
3.4.1.2. Mô hình gây rối loạn lipid máu nội sinh
Sử dụng và điều chỉnh mô hình gây tăng lipid máu nội sinh bằng P-407 theo Millar và cộng sự [91].
Chuẩn bị dung dịch P- 407 2% bằng cách pha 0,4g P-407 trong 20ml nƣớc muối sinh lý 0,9%, để tủ lạnh qua đêm để làm tăng độ tan của P-407. Kim và xylanh dùng để tiêm chuột đƣợc ngâm trong nƣớc đá trƣớc khi sử dụng.
Chuột nhắt trắng đƣợc chia làm 5 lô, mỗi lô 10 con. Các lô đƣợc tiêm và uống thuốc nhƣ sau:
- Lô 1 (chứng sinh học): Tiêm màng bụng nƣớc muối sinh lý 0,9% với thể tích 0,1ml/10g thể trọng chuột, sau đó uống nƣớc cất
- Lô 2 (mô hình): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200mg/kg (0,1ml/10g), ngay sau đó uống nƣớc cất
- Lô 3 (chứng dƣơng): Tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200mg/kg (0,1ml/10g), ngay sau đó uống atorvastatin liều 100mg/kg với thể tích 0,2ml/10g
- Lô 4 (thuốc thử liều tƣơng đƣơng lâm sàng): Tiêm màng bụng dung dịch P- 407 2% liều 200mg/kg (0,1ml/10g), ngay sau đó uống thuốc thử SAD liều tƣơng đƣơng với liều trên lâm sàng 0,72 g cao khô/kg/ ngày với thể tích 0,2ml/10g ( hệ số 12)
- Lô 5 (thuốc thử liều gấp ba trên lâm sàng): Tiêm màng bụng dung dịch P- 407 2% liều 200mg/kg (0,1ml/10g), ngay sau đó uống thuốc thử SAD liều 2,16g cao khô/kg/ngày (gấp 3 lần liều trên lâm sàng) với thể tích 0,2ml/10g.
Chuột đƣợc uống nƣớc cất và thuốc thử suốt 7 ngày liên tục trƣớc khi tiêm màng bụng dung dịch P-407. Sau khi đƣợc tiêm P-407, chuột đƣợc cho nhịn đói hoàn toàn nhƣng vẫn đƣợc uống nƣớc tự do. Sau 24 giờ kể từ khi đƣợc tiêm P-407, tất cả các chuột đƣợc lấy máu động mạch cảnh làm xét nghiệm định lƣợng TG, TC, LDL-C, HDL-C.
LDL-C đƣợc tính theo công thức Friedewald [50]
LDL-C = TC – (HDL-C) – (TG/2,2) (mmol/L)
N: Ngày nghiên cứu
Hình 2.2. Quy trình nghiên cứu
3.4.2. Mô hình gây rối loạn lipid máu và vữa xơ động mạch
Chuẩn bị dầu cholesterol: mỗi lần cân 100g cholesterol. Đun nóng cách thuỷ 100mL dầu lạc, cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết, để nguội, cuối cùng cho thêm dầu lạc vừa đủ 320mL.
Chuột nhịn đói hoàn toàn
N7 N8
Uống nƣớc cất hoặc thuốc thử
Tiêm màng bụng P-407/NaCl 0,9%
Định lƣợng TC, TG, LDL-C, HDL-C N1
Thỏ đƣợc chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con. Các lô đƣợc gây tăng lipid máu và VXĐM và uống thuốc thử trong 8 tuần nhƣ sau:
- Lô 1 (lô chứng sinh học): Hàng ngày thỏ chỉ uống nƣớc lọc với thể tích 5ml/kg
- Lô 2 (lô mô hình): Hàng ngày thỏ đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1ml/kg, sau đó 2 giờ cho uống nƣớc lọc 5ml/kg thể trọng thỏ
- Lô 3 (lô uống atorvastatin): Hàng ngày thỏ đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1ml/kg, sau đó 2 giờ cho uống atorvastatin với liều 5mg/kg.
- Lô 4 (lô uống thuốc thử liều tương đương lâm sàng): Hàng ngày thỏ đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1ml/kg, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử (liều tƣơng đƣơng liều lâm sàng ở ngƣời, tính theo hệ số 3) là 0,18 g cao khô/kg / ngày
- Lô 5 (lô uống thuốc thử liều gấp ba lần trên lâm sàng): Hàng ngày thỏ đƣợc uống hỗn hợp dầu cholesterol liều 0,5g/kg, 1ml/kg, sau đó 2 giờ cho uống thuốc thử liều cao gấp 3 lần liều lâm sàng là 0,54 g cao khô/ kg/ ngày
Nƣớc + nƣớc Lô 1 (n = 10) Tuần 0 4 8 Dầu cholesterol + nƣớc Lô 2 (n = 10) Tuần 0 4 8 Dầu cholesterol + Atorvastatin 5mg/kg/ngày Lô 3 (n = 10) Tuần 0 4 8 Dầu cholesterol + SAD 0,18 g/kg/ngày
Lô 4 (n = 10) Tuần 0 4 8 Dầu cholesterol + SAD 0,54 g/kg/ngày
0 4 8
Tiến hành cân kiểm tra trọng lƣợng thỏ ở tất cả các lô tại thời điểm trƣớc, sau thí nghiệm, hàng tuần. Vào ngày đầu tiên, sau 4 tuần, 8 tuần của thí nghiệm, thỏ trong các lô cho nhịn ăn qua đêm. Lấy máu ngoại vi và tiến hành định lƣợng TC, TG, HDL-C, LDL-C
Các thông số đánh giá gồm:
- Các chỉ số sinh hóa máu: định lƣợng cholesterol toàn phần (TC), triglyceride (TG), HDL- cholesterol (HDL-C), LDL- cholesterol (LDL- C).
- Các chỉ số đánh giá về tình trạng xơ vữa động mạch chủ và tình trạng nhiễm mỡ của gan thỏ: Tại thời điểm sau 8 tuần uống thuốc, giết ngẫu nhiên 50% số động vật ở tất cả các lô để xét nghiệm đại thể, vi thể của động mạch chủ đoạn ngay trƣớc khi đổ vào động mạch vành và tình trạng nhiễm mỡ của gan thỏ (có ảnh vi thể kèm theo).
3.5. Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc nhập và xử lý bằng phƣơng pháp và thuật toán thống kê y sinh học trên phần mềm Excel 2010.
Số liệu đƣợc biểu diễn dƣới dạng X SD. Kiểm định các giá trị bằng t-test Student hoặc test trƣớc-sau.
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Chú thích
p ≤ 0,05 p ≤ 0,01 p ≤ 0,001
Khác biệt so với lô chứng sinh học + ++ +++
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tác dụng điều chỉnh lipid máu của SAD trên mô hình gây RLLPM nội sinh Bảng 3.1.Mô hình rối loạn lipid máu nội sinh bằng Poloxamer 407 Bảng 3.1.Mô hình rối loạn lipid máu nội sinh bằng Poloxamer 407
Chỉ số lipid Chứng sinh học (n = 10) ( SD, mmol/L) Mô hình (n = 10) ( SD, mmol/L) TG 0,62 ± 0,05 8,60 ± 1,38+++ TC 2,70 ± 0,24 7,80 ± 1,06+++ HDL-C 1,01 ± 0,14 2,07 ± 0,17+++ non-HDL-C 1,69 ± 0,28 5,73 ± 1,13+++
Kết quả bảng 3.1 cho thấy: tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200 mg/kg (0,1mL/10g) có tác dụng gây RLLPM rõ rệt: ở lô mô hình, TG tăng tới 1287,10%; TC tăng 188,89%; HDL-C tăng 104,95% và non-HDL-C tăng 239,05%.
Bảng 3.2. Sự thay đổi nồng độ lipid máu chuột nhắt trắng ở mô hình RLLPM nội sinh
Lô nghiên cứu TG
(mmol/L) TC (mmol/L) HDL-C (mmol/L) Non-HDL-C (mmol/L) Lô 2: Mô hình 8,6 ± 1,38 7,8 ± 1,06 2,07 ± 0,17 5,73 ± 1,13 Lô 3:Atorvastatin 100mg/kg 7,56 ± 2,57 5,13 ± 1,03 p3-2<0,001 1,90 ± 0,28 3,23 ± 1,11 p3-2<0,001
% giảm so với mô hình ↓ 34,23% ↓ 43,63%
Lô 4: SAD liều 0,72g cao
khô/kg/ngày 7,25±1,78
6,74 ± 1,03
p4-2<0,05 1,96 ± 0,35
4,79 ± 0,88
p4-2<0,05
% giảm so với mô hình ↓ 13,56% ↓ 16,40%
Lô 5: SAD liều 2,16 g cao
khô/kg/ ngày 7,11 ± 2,19
6,67 ± 1,03
p5-2<0,05 1,92 ± 0,29
4,75 ± 0,09
p5-2<0,05
Bảng 3.2 thể hiện nồng độ các chỉ số lipid máu của chuột nhắt trắng ở các lô mô hình và các lô dùng thuốc tại thời điểm 24 giờ sau khi tiêm màng bụng dung dịch P-407 để gây RLLPM nội sinh.
- Các lô chuột uống atorvastatin liều 100 mg/kg và uống SAD các liều đều