1.2.1. Giảo cổ lam
Tên khoa học:
Gynostemma pentaphyllum (thunb.) Makino Cucurbitaceae họ Bí Tên khác: Cỏ Thần kỳ, Ngũ diệp sâm, cây Trƣờng thọ.
Hình thái thực vật là loài thân thảo, dây nhỏ dài có tua cuốn (vòi nhƣ bầu bí), lá có dạng chân gà, thƣờng có 5 - 7 lá nhỏ, quả khô hình cầu, đƣờng kính 5 - 9 mm, khi chín có mầu đen. Cụm hoa hình chuỳ mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa rời nhau xòe hình sao, bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhuỵ. Thời kì ra hoa từ tháng 6 - 8, thời kì ra quả tháng 9 - 10, thu hoạch vào tháng 11 - 12 hàng năm [4], [26].
Thành phần hóa học chính của giảo cổ lam là flavonoid, saponin, sterol và các loại đƣờng. Saponin trong giảo cổ lam là gypenosid có cấu trúc tri-terpen, tồn tại chủ yếu ở dạng glycosid nhiều gấp 3 - 4 lần so với nhân sâm [4]. Thành phần flavonoid của giảo cổ lam ít đƣợc nghiên cứu hơn. Có ba flavonoid đƣợc tìm thấy là ombuin, ombuoisde và rutin [2],[30]. Sterol trong giảo cổ lam chứa khoảng 0,0001% bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol. Ngoài ra, giảo cổ lam còn chứa các vitamin và các chất khoáng khác nhau [99].
Giảo cổ lam là cây thuốc đã đƣợc dùng từ rất lâu trong y học cổ truyền Trung Quốc. Giảo cổ lam có tính hàn, vị ngọt đắng, vào các kinh Tỳ, Phế, Tâm, và Thận. Có tác dụng ích khí kiện tỳ (tăng cƣờng tiêu hóa), thanh nhiệt giải độc, dƣỡng tâm an thần, chủ trị khí hƣ âm thƣơng (phần khí, phần âm bị tổn thƣơng)…
Trong nghiên cứu, thực hành lâm sàng, giảo cổ lam đƣợc chứng minh có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đƣờng, sử dụng giúp hạ áp, hạ lipid máu [35], [58],[89].
Tại Việt Nam, giảo cổ lam đƣợc Phạm Thanh Kỳ nghiên cứu từ năm 1997 (đề tài cấp Quốc gia mã số KC.07.03.03) và đƣợc Viện dƣợc liệu Trung ƣơng, Đại học Y Hà Nội kết hợp với Thụy Điển nghiên cứu chuyên sâu về tác dụng hạ đƣờng huyết. Giảo cổ lam làm hạ cholesterol toàn phần trong máu, làm tăng miễn dịch và
Hình 1.6: Cây giảo cổ lam
Gynostemma pentaphyllum (thunb.) Makino Cucurbitaceae
nâng cao sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u một cách rõ rệt [25].
Một số nghiên cứu về tác dụng trên chuyển hóa lipid của giảo cổ lam
Tác dụng của giảo cổ lam trên chuyển hóa lipid trên động vật thực nghiệm
- Tác dụng hạ lipid đã đƣợc nghiên cứu khi dùng nƣớc sắc của giảo cổ lam cùng với hai loại dƣợc liệu khác, hỗn hợp này giảm đáng kể nồng độ TG và cholesterol trong huyết tƣơng thỏ và chim cút [84].
- Nghiên cứu của Bùi Thị Quỳnh Nhung (2011) về tính an toàn và tác dụng hạ glucose máu của Vinabetes (gồm 3 loại dƣợc liệu: tri mẫu, bằng lăng nƣớc, giảo cổ lam) trên chuột cống gây mô hình ĐTĐ typ 2 béo phì cũng cho thấy tác dụng hạ glucose máu và lipid máu rất tốt [35].
- Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Dẫn (1999), đã định lƣợng flavonoid , saponin toàn phần và tác dụng dƣợc lý của cây giảo cổ lam, kết quả nghiên cứu đã khẳng định khả năng hạ cholesterol máu của dịch chiết dƣợc liệu có tác dụng ức chế sự tăng cholesterol máu ở chuột ăn cholesterol hàng ngày 71% so với nhóm đối chứng [6].
- Nghiên cứu của Samer M. và cộng sự (2006) về ảnh hƣởng của giảo cổ lam trên nồng độ glucose máu và lipid máu ở chuột Zucker béo phì, kết quả cho thấy giảo cổ lam ở liều 250mg/kg cân nặng có tác dụng hạ glucose máu, hạ lipid máu rõ rệt [101].
- Nghiên cứu của Haiyun W. và cộng sự (2009) đã chứng minh gypenosid đƣợc chiết xuất từ giảo cổ lam với liều 250mg/kg có tác dụng làm giảm đáng kể TC, TG trong máu chuột đƣợc gây mô hình tăng lipid cấp và mạn tính [67].
- Trong liệu pháp gây béo phì bằng chế độ ăn giàu lipid, chuột cống đƣợc điều trị bằng dịch chiết thô từ giảo cổ lam trong 4 tuần. Kết quả cho thấy nồng độ TG trong máu giảm rõ rệt [71].
- Chuột cống Wistar đƣợc nuôi bằng thức ăn có hàm lƣợng chất béo và lƣợng đƣờng cao, sau 7 tuần điều trị bằng gypenosid toàn phần từ giảo cổ lam 100 mg/kg chuột, làm giảm lƣợng TG và cholesterol toàn phần là 32% và 34%. Trong khi nhóm đƣợc điều trị bằng gypenosid toàn phần từ giảo cổ lam 500 mg/kg chuột làm nồng độ TG và cholesterol toàn phần giảm tƣơng đƣơng chuột bình thƣờng, cùng với đó lƣợng lipid peroxid trong huyết tƣơng và gan cũng giảm rõ rệt [82],[83].
- Ở mô hình gây tăng lipid trên chuột nhắt, gypenosid (300mg/kg) làm giảm cholesterol và TG lần lƣợt là 12% và 39,1% [98], với liều gypenosid 700mg/kg, lƣợng cholesterol, TAG, β-lipoprotein huyết tƣơng giảm lầm lƣợt là 60,7%, 41,3% và 37,8%, đồng thời HDL tăng 50,6% [110].
- Dịch chiết giảo cổ lam (1:1) có khả năng hạ cholesterol trên thỏ theo phƣơng pháp gây tăng cholesterol nội sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng với liều 5 g/kg thể trọng thỏ/ ngày dùng trong 4 ngày liền, tác dụng hạ cholesterol máu có ý nghĩa thống kê p <0,02 so với lô không điều trị [2].
Một số nghiên cứu trên lâm sàng về giảo cổ lam trên chuyển hóa lipid
- Nghiên cứu giảo cổ lam đã đƣợc thực hiện nhiều ở các viện, các trƣờng đại học ở Trung Quốc. Một thử nghiệm trên 300 bệnh nhân từ bệnh viện hữu nghị Sino-Japan, sử dụng dạng viên nang mềm chứa dịch chiết giảo cổ lam toàn phần, đã cho thấy sự giảm rõ rệt lƣợng cholesterol, TG, và tăng HDL-C [65].
- Wang và cộng sự đã thử nghiệm trên một nhóm 94 bệnh nhân bị tăng lipid máu. Sau 8 tuần điều trị, gypenosid làm giảm cholesterol toàn phần (6,7%), TG (12,8%), LDL (8,3%) và tỷ lệ non-HDL/LDL (10,4%), cũng gây tăng HDL (8,4%) với p < 0,001 [107]
1.2.2. Cây chóc máu
Tên khác: Cây chóp máu, chóp mào, chóp mao họ Dây gối Celastraceae
Đặc điểm thực vật: một loài dây leo cao 1–2 m, cành nhỏ có cạnh, mặt dƣới lá màu lục nâu; quả mọng, hình quả lê, chóp quả màu đỏ.
Tại Việt Nam, ngoài Vƣờn quốc gia Bạch
Mã, nơi đang bảo tồn nguồn gen chóc máu thì ở núi Kim Phụng, thôn Hải Cát, xã Hƣơng Thọ, huyện Hƣơng Trà, tỉnh Thừa Thiên-Huế ngƣời dân cũng đã phát hiện loài dƣợc liệu này [4], [7]
Bộ phận sử dụng: Rễ cây rửa sạch, thái lát, phơi khô Thành phần hóa học: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo nghiên cứu của tác giả Trần Thị Minh, Nguyễn Thị Hoàng Oanh, Trần Văn Sung (Viện Hóa Học, Viện Khoa học và công nghệ Hà Nội) thành phần trong phân đoạn n-hexan, bằng phƣơng pháp sắc kí kết hợp với phƣơng pháp phổ hiện đại đã phân lập và nhận dạng đƣợc 3 chất triterpen có các khung hopan, lupan, friedel, taraxeran từ Salacia [29].
Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây chóc máu, Đỗ Thị Nguyệt Quế (2013) đã ban đầu đánh giá tác dụng của một số chất tinh khiết trong phân đoạn n-hexan: Friedelan-3β-ol; 21α, 30-dihydroxyfriedelan và β-sitosterol lên glucose huyết. Trên chuột cống trắng gây tăng glucose máu bằng STZ, dịch chiết toàn phần, phân đoạn n-hexan, phân đoạn ethylacetat đều có tác dụng làm hạ đƣờng huyết. Trên chuột cống gây ĐTĐ dạng typ 2 bằng HFD và STZ, dịch chiết toàn phần và phân đoạn n-hexan có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ cholesterol toàn phần [36].
Ngoài ra, dịch chiết từ lá cây còn chứa mangiferin có hoạt tính kháng virus cao [29], các hợp chất quercitrin, phenolic, glycoside cũng đƣợc tìm thấy trong lá
cây [105].
Hình 1.7. Cây chóc máu
Salacia cochichinensis Lour., Celastraceae
Tác dụng: Quả và rễ là những phần hữu ích. Rễ cây đã đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc trị đái tháo đƣờng. S. chinensis đã đƣợc sử dụng ở Ấn Độ và ở một số nƣớc khác nhƣ một loại thuốc bổ, lọc máu và điều trị vô kinh, đau bụng kinh. Vỏ rễ của nó đã đƣợc sử dụng trong bệnh lậu, bệnh thấp khớp và bệnh ngoài da. Nƣớc dịch chiết của cây đƣợc chứng minh có tác dụng hạ đƣờng huyết [50].
Ngoài ra cây chóc máu còn có tác dụng hạn chế sự phát triển tế bào u bƣớu, trong kinh nghiệm dân gian dùng để trị viêm khớp, phong thấp, đau lƣng, mỏi gối, cơ thể suy nhƣợc.
1.2.3. Các nghiên cứu về SAD
Nghiên cứu của Nguyễn Trọng Thông và Cs (2014) về tác dụng hạ glucose máu của chế phẩm SAD trên động vật thực nghiệm và Đỗ Thị Thu Hƣớng (2014) [17], [43], nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu của chế phẩm SAD trên mô hình gây đái tháo đƣờng typ2 ở động vật thực nghiệm. Kết quả cho thấy:
- Trên chuột nhắt trắng gây ĐTĐ dạng typ 1, SAD liều 750 mg/kg cân nặng/ngày và liều 3750 mg/kg cân nặng/ngày uống liên tục 1 tuần không làm thay đổi nồng độ glucose máu trên chuột nhắt trắng gây ĐTĐ dạng typ 1 bằng alloxan liều 250 mg/kg.
- Trên chuột nhắt trắng đƣợc gây ĐTĐ dạng typ 2
SAD cả 2 liều 750 mg/kg cân nặng/ngày và 3750 mg/kg/ngày uống liên tục trong 2 tuần làm giảm rõ nồng độ glucose máu trên chuột nhắt trắng ĐTĐ dạng typ 2 so với thời điểm trƣớc uống thuốc và giảm rõ rệt so với lô mô hình (p < 0,05).
Tác dụng hạ glucose máu của SAD ở cả 2 liều 750 mg/kg/ ngày và 3750 mg/kg/ngày không có sự khác biệt khi so sánh với nhau (p > 0,05) và khi so sánh với gliclazid liều 80mg/kg /ngày (p > 0,05).
- Ngoài ra, kết quả nghiên cứu còn cho thấy bên cạnh tác dụng hạ glucose máu SAD còn có tác dụng hạ lipid máu rõ rệt. SAD ở cả 2 liều 750
mg/kg/ngày và liều 3750 mg/kg/ngày uống liên tục trong 2 tuần đều có tác dụng làm giảm rõ nồng độ cholesterol toàn phần, triglycerid và LDL-C của chuột nhắt trắng ĐTĐ dạng typ 2 có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05).
Qua kết quả trên cho thấy SAD vừa có tác dụng hạ glucose máu vừa có tác dụng hạ lipid máu, một rối loạn chuyển hóa kép thƣờng gặp trên lâm sàng. Tuy nhiên, để trả lời câu hỏi liệu SAD thật sự có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid hay không, cần phải tiến hành nghiên cứu trên các mô hình chuyên về đánh giá tác dụng trên lipid. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu và giảm xơ vữa động mạch của chế phẩm SAD trên động vật thực nghiệm” là cần thiết.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên liệu nghiên cứu
3.1.1. Chất liệu nghiên cứu
SAD do công ty TNHH Tuệ Linh cung cấp, SAD là sự kết hợp giữa:
Cao khô giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (thunb.) Makino cucurbitaceae)
và cao khô rễ chóc máu (Salacia cochichinensis Lour., Celastraceae) theo tỷ lệ 1:1. Giảo cổ lam và rễ chóc máu đƣợc chiết nóng, dung môi nƣớc, sau đó phun sấy tần sôi. Trong nghiên cứu này, SAD đƣợc cho động vật thử nghiệm uống nên trƣớc khi uống, thuốc thử đƣợc pha trong dung môi là nƣớc tao thành hỗn dịch với tỷ lệ thích hợp tùy nghiên cứu.
Cao khô giảo cổ lam và cao khô rễ chóc máu: Theo tiêu chuẩn cơ sở (phụ lục 1 và phụ lục 2).
3.1.2. Hoá chất và dụng cụ xét nghiệm
3.1.2.1. Hoá chất phục vụ nghiên cứu
- Cholesterol tinh khiết (Merck – Đức) - Dầu lạc (công ty Trƣờng An – Việt Nam)
- Propylthiouracil viên nén 50 mg (biệt dƣợc Lothisil ® - Young IL Pharma Hàn Quốc SĐK: VN-11252-10
- Acid cholic (Sigma – Singapore) - Poloxamer 407 (Sigma – Singapore)
- Atorvastatin viên nén 20 mg (Dƣợc phẩm Hậu Giang) SĐK: VD- 18910-13 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Kit định lƣợng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: TC, TG, LDL-C, HDL-C, ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat
aminotransferase) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo).
- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
3.1.2.2. Máy móc phục vụ nghiên cứu
Máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).
3.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Động vật thực nghiệm đƣợc nuôi 3 ngày trƣớc khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn riêng cho từng loại tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
Nơi cung cấp thức ăn: Công ty liên doanh Guyomarc’h-VCN và Viện Vệ sinh dịch tễ trung ƣơng.
Cụ thể:
Bảng 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nghiên cứu Động vật thực
nghiệm Tiêu chuẩn
Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên mô hình gây RLLPM ngoại sinh
Chuột cống trắng chủng Wistar
Khoẻ mạnh, trọng lƣợng từ 200-300g Tác dụng điều chỉnh RLLPM trên
mô hình gây RLLPM nội sinh
Chuột nhắt trắng chủng Swiss Giống đực, khoẻ mạnh, trọng lƣợng 25±2g Tác dụng giảm VXĐM Thỏ chủng Newzealand White Khoẻ mạnh, trọng lƣợng 1,8-2,5kg
3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu
+ Các nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu, giảm xơ vữa mạch máu đều đƣợc tiến hành tại Bộ môn Dƣợc lý – Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
+ Các xét nghiệm sinh hoá, định lƣợng các chất trong các nghiên cứu trên đều đƣợc thực hiện tại phòng xét nghiệm, Bộ môn Dƣợc lý – Đại học Y Hà Nội.
+ Các xét nghiệm đánh giá tổn thƣơng giải phẫu bệnh động mạch chủ và gan đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và phát hiện sớm ung thƣ – Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam (do PGS.TS Lê Đình Roanh đọc kết quả).
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/ 2014 đến tháng 7/ 2015.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
3.4.1. Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của chế phẩm
Theo thông tin của nhà sản xuất, liều dùng SAD ở ngƣời là 6 viên/ngày tƣơng đƣơng 3g cao/ngày.
- Ngoại suy liều trên chuột nhắt (hệ số 12)
Dựa trên phƣơng pháp tính liều ngoại suy để tính liều cho động vật thực nghiệm trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng liều tƣơng đƣơng với liều dùng trên ngƣời là 0,72 g cao khô/kg/ngày.
Chế phẩm SAD Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh RLLPM Nghiên cứu tác dụng hạn chế VXĐM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mô hình gây rối loạn lipid máu
ngoại sinh
Mô hình gây rối loạn lipid máu nội
Vì vậy, nghiên cứu trên chuột nhắt trắng sử dụng 2 mức liều là 0,72 g cao khô /kg/ngày và liều gấp 3 lần trên lâm sàng là 2,16 g cao khô /kg/ngày.
- Ngoại suy liều ở chuột cống (hệ số 6)
Chuột cống liều tƣơng đƣơng trên lâm sàng là 0,36 g cao khô/ kg /ngày. Liều cao gấp 3 trên lâm sàng là 1,08 g cao khô/ kg/ ngày
- Ngoại suy liều ở thỏ (hệ số 3)
Trên thỏ liều tƣơng đƣơng trên lâm sàng là 0,18 g cao khô/ kg/ngày. Liều cao gấp 3 trên lâm sàng là 0,54 g cao khô/ kg /ngày.
3.4.1.1. Mô hình gây rối loạn lipid máu ngoại sinh
Mô hình gây rối loạn lipid máu ngoại sinh đƣợc thực hiện bằng cách cho chuột cống trắng uống hỗn hợp dầu chứa cholesterol (trong 1ml hỗn hợp dầu cholesterol chứa: 0,1g cholesterol, 0,01g acid cholic và 0,005g propylthiouracil) với liều 10 ml/kg (1 ml/100g) cân nặng mỗi ngày vào buổi sáng, trong suốt 4 tuần liên tục (28 ngày) để gây tăng RLLPM.
Chuẩn bị hỗn hợp dầu cholesterol
- Cân 50g cholesterol
- Đun nóng cách thuỷ 200 ml dầu lạc, cho cholesterol vào, khuấy đều cho tan hết, để nguội, cho thêm 5g acid cholic và 2,5g propylthiouracil, cuối cùng cho thêm dầu lạc vừa đủ 500ml
- Trong 1ml hỗn hợp dầu cholesterol chứa: 0,1g cholesterol, 0,01g acid cholic và 0,005g propylthiouracil.
Bổ sung acid cholic và PTU là một biện pháp để làm tăng hấp thu cholesterol và làm giảm chuyển hoá cholesterol thành acid mật, vì vậy gây đƣợc mô hình có độ ổn định, độ đồng nhất cao hơn và rút ngắn thời gian nghiên cứu (Bảng 2.2)
Theo nghiên cứu của Nguyễn Phƣơng Thanh để gây mô hình RLLPM ngoại sinh trên chuột cống trắng với mục đích vẫn gây đƣợc mô hình để đánh giá tác dụng cùa thuốc, nhƣng hạn chế đƣợc số lƣợng acid cholic phải sử dụng vì giá thành còn tƣơng đối cao [40].
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp dầu cholesterol
Thành phần Mô hình Nassiri (2009) Mô hình đã điều chỉnh
Cholesterol (g/ml) 0,1 0,1
Acid cholic (g/ml) 0,1 0,01
PTU (g/ml) 0,03 0,005
Dầu lạc vừa đủ 1 ml 1 ml
Chuột cống đƣợc chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, các lô đƣợc uống thuốc trong 4 tuần nhƣ sau:
- Lô 1 (lô chứng sinh học, n=10): Hàng ngày chuột chỉ uống nƣớc cất với cùng