máu nội sinh
Lựa chọn tác nhân gây mô hình RLLPM nội sinh
Mô hình gây RLLPM nội sinh bằng cách dùng các chất ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp, chuyển hóa lipid tại gan. Các chất hay đƣợc sử dụng để gây mô hình tăng cholesterol máu nội sinh là Tween 80, Triton WR1339 (Tyloxapol) và P407, đã đƣợc chứng minh có cơ chế là làm tăng tổng hợp cholesterol tại gan. Millar và cộng sự tiến hành so sánh mô hình gây tăng lipid máu trên chuột nhắt bằng Tyloxapol liều 500mg/kg và Poloxamer 407 liều 1g/kg cho thấy Poloxamer 407 làm tăng rõ rệt nồng độ TC và TG máu sau 24 giờ, Poloxamer 407 có ƣu điểm so với Tyloxapol là có ít tác dụng phụ hơn [75]. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn P407 vì P-407 là một chất có hiệu quả và an toàn trong việc gây mô hình gây RLLPM nội sinh trên động vật thực nghiệm [40][76][91]. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả chuột ở các lô sau khi đƣợc tiêm P-407 đều không có dấu hiệu bất thƣờng nào về tình trạng chung nhƣ: chuột vẫn đi lại bình thƣờng, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mƣợt, phân khô, không có chuột nào chết. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với những đánh giá về tính an toàn của P-407 nói trên.
Cơ chế gây RLLPM của P-407 đã đƣợc chứng minh là có liên quan đến nhiều enzym khác nhau trong quá trình chuyển hóa lipid: ức chế các enzym lipoprotein lipase (LPL) huyết tƣơng [78], cholesterol 7α-hydroxylase (C7αH) [77]; tăng số lƣợng và hoạt động của 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, giảm số lƣợng LDL receptor (LDLr) tại gan [85].
Nhƣ vậy, khi sử dụng P-407 gây RLLPM trên thực nghiệm sẽ gây ra tình trạng tăng cả TG và cholesterol máu.
Lựa chọn thuốc chứng dương và liều sử dụng
Các dẫn xuất statin có cấu trúc gần giống với HMG-CoA nên ức chế cạnh tranh HMG-CoA reductase làm giảm tổng hợp cholesterol, đồng thời cũng làm tăng sinh LDL-r ở màng tế bào, vì vậy, dẫn xuất statin đƣợc lựa chọn ƣu tiên trong những trƣờng hợp tăng cholesterol máu [42]. Bên cạnh đó, các thuốc trong nhóm statin cũng có tác dụng hạ TG máu do[55]:
- Tăng số lƣợng LDL-r cũng làm giảm nồng độ các LP tiền thân của LDL (VLDL và IDL)
- Giảm tổng hợp cholesterol làm giảm lắp ráp VLDL tại gan.
Dựa vào khả năng hạ TG và cholesterol của các dẫn xuất statin, chúng tôi lựa chọn nhóm statin làm thuốc chuẩn để so sánh với hiệu quả của thuốc thử trong mô hình gây RLLPM nội sinh bằng P-407. Các thuốc statin đƣợc sử dụng hiện nay có mức độ hạ cholesterol máu và TG máu khác nhau: statin có tác dụng hạ cholesterol máu tốt hơn cũng có tác dụng tốt hơn trong hạ TG máu [103]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mức độ hạ cholesterol của các statin theo thứ tự: fluvastatin < pravastatin < lovastatin < simvastatin < atorvastatin < rosuvastatin [60],[94]. Sử dụng rosuvastatin làm thuốc chứng dƣơng có thể sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên do giá thành của rosuvastatin khá đắt, nên atorvastatin là một lựa chọn thay thế hợp lý. Do thời gian thực hiện mô hình nội sinh ngắn nên liều atorvastatin cũng nhƣ thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu cần cao hơn so với liều điều trị thông thƣờng mới có thể đánh giá đƣợc tác dụng điều chỉnh RLLPM.
Chúng tôi chọn liều atorvastatin 100 mg/kg trên chuột nhắt trắng (gấp khoảng 5 lần liều điều trị trên chuột nhắt tính tƣơng đƣơng liều điều trị trên ngƣời) là vì thời gian tiến hành nghiên cứu nội sinh diễn ra trong 1 tuần, khá ngắn, nên để đánh giá đƣợc chính xác tác dụng điều chỉnh RLLPM của bài thuốc, chúng tôi sử dụng atorvastatin với liều cao.
Từ liều atorvastatin, chúng tôi chọn liều SAD cao nhất là 2,16 g cao /kg (liều
cao gấp 3 lần liều dùng trên người tính theo hệ số 12), liều thử thấp hơn là 0,72 g
Để lựa chọn liều P-407 gây mô hình, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng của P-407 phụ thuộc liều, mức độ RLLPM thấp hơn nếu dùng liều thấp [76]. Nguyễn Phƣơng Thanh tiến hành nghiên cứu tác dụng điều chỉnh RLLPM của Monacholes trên mô hình gây RLLPM nội sinh bằng P-407 liều 500mg/kg, thuốc chuẩn (lovastatin) và thuốc thử đƣợc uống ngay sau khi tiêm màng bụng P-407 (lƣợng thuốc đƣợc chia ra làm 3 lần, cách nhau 2 giờ). Kết quả cho thấy, 24 giờ sau khi tiêm màng bụng P-407, tại lô mô hình, tất cả các thông số lipid máu (TG, TC, HDL-C, LDL-C) đều tăng lên rất cao, trong đó tăng cao nhất là nồng độ TC, gấp khoảng 10 lần so với nhóm chứng. Lovastatin liều 150 mg/kg (gấp khoảng 30 lần liều điều trị trên chuột nhắt tính tƣơng đƣơng liều điều trị trên ngƣời) mặc dù có xu hƣớng làm giảm các chỉ số TC (giảm 13,7%), LDL-C (giảm 15,2%) so với lô mô hình nhƣng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể giải thích là do nồng độ lipid trong máu của chuột tăng quá cao (gấp hơn 10 lần) và độ lệch lớn nên khó có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm thuốc chuẩn và nhóm mô hình. Lovastatin cũng nhƣ Monacholes không đƣợc uống kéo dài trƣớc khi tiến hành gây mô hình cũng là một yếu tố góp phần khiến tác dụng của thuốc chuẩn và thuốc thử chƣa biểu hiện rõ [40]. Để đánh giá hiệu quả của các thuốc tốt hơn, chúng tôi đã lựa chọn liều P-407 là 200 mg/kg, giảm hơn một nửa so với liều P-407 trong nghiên cứu của Nguyễn Phƣơng Thanh, atorvastatin và SAD cũng đƣợc uống kéo dài 7 ngày trƣớc khi gây mô hình.
Kết quả nghiên cứu
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy, ở các lô đƣợc tiêm màng bụng P-407, tất cả các thông số lipid máu đều tăng lên rõ rệt so với lô chứng sinh học, trong đó tăng cao nhất là nồng độ TG (gấp khoảng 14 lần so với nhóm chứng), nồng độ TC và nồng độ non-HDL-C tăng ít hơn, gấp khoảng 3 lần so với nhóm chứng. Kết quả này cũng đồng thuận với nhiều nghiên cứu trên chuột cống và chuột nhắt, mức tăng TG huyết tƣơng do P-407 gây ra thƣờng lớn hơn so với mức tăng TC [108], [111]. Do nồng độ TG tăng quá cao nên ở các lô uống atorvastatin và SAD đều chƣa nhận thấy có sự thay đổi nồng độ TG so với lô mô hình mặc dù các thuốc thử đã đƣợc uống kéo dài 7 ngày trƣớc khi gây mô hình.
Kết quả nghiên cứu với nồng độ TG tăng quá cao ở các lô đƣợc tiêm màng bụng P-407 đã không cho phép tính toán nồng độ LDL-C theo công thức Friedewald. Chƣơng trình giáo dục Quốc gia về cholesterol của Mỹ (NCEP) và nhiều tổ chức khoa học khác coi nồng độ LDL-C là tiêu chí chính để chẩn đoán và quản lý bệnh nhân tăng lipid máu [81], [92]. Để phân loại chính xác các bệnh nhân RLLPM theo bảng phân loại của NCEP, LDL-C đƣợc tính toán với tổng sai số trung bình không quá 12% [52]. Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm và trong các nghiên cứu quy mô lớn đều tính nồng độ LDL-C huyết thanh theo công thức Friedewald.
Nguyên tắc của công thức Friedewald dựa trên các giả định: TC đƣợc phân bố trong ba nhóm LP chủ yếu (HDL, VLDL và LDL), và VLDL vận chuyển hầu hết TG trong máu, do đó VLDL-C có thể đƣợc ƣớc tính dựa vào nồng độ TG máu (TG/5 với đơn vị mg/dL hoặc TG/2,2 với đơn vị mmol/L). LDL-C sau đó đƣợc tính nhƣ sau: LDL-C = TC– (HDL-C) –TG/5 [64]. Công thức Friedewald tƣơng đối tin cậy và đƣợc NCEP khuyến cáo nhƣ một phƣơng pháp thông thƣờng để tính LDL-C vì giá thành rẻ và dễ thực hiện [52], [92]. Tuy nhiên công thức Friedewald cũng có những hạn chế: (1) việc tính toán LDL-C dựa trên định lƣợng ba thông số lipid máu khác (TC, HDL-C, TG) làm tăng sai số, và (2) công thức này không đáng tin cậy khi nồng độ TG > 400 mg/dL hay > 4,52 mmol/L [90], thậm chí độ tin cậy của công thức cũng giảm với nồng độ TG từ 200 – 400 mg/dL (2,26 – 4,52 mmol/L) và chỉ thực hiện đƣợc khi nhịn đói ít nhất 8-12 giờ trƣớc xét nghiệm để loại trừ sự tồn tại của CM trong huyết thanh [53].
Kết quả ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 cho thấy, nồng độ TG ở các lô đƣợc tiêm
màng bụng P-407 đều lớn hơn rất nhiều giới hạn đáng tin cậy của nồng độ TG để có thể tính toán nồng độ LDL-C theo công thức Friedewald.
LDL-C không phải là thành phần LP duy nhất gây xơ vữa, các LP chứa apo-B khác (VLDL, VLDL tàn dƣ, CM tàn dƣ, IDL- những LP chứa nhiều TG) đều có khả năng gây xơ vữa. Do đó, định lƣợng nồng độ apo-B toàn phần trong huyết tƣơng đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp định lƣợng các phân tử có khả năng gây XVĐM [54]. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không đƣợc thực hiện rộng rãi tại các phòng thí
nghiệm. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh nồng độ TG tăng cũng là một yếu tố nguy cơ đối với bệnh mạch vành [52].
Vì vậy, NCEP đã đƣa ra chỉ số non-HDL-C nhƣ một đích điều trị mới ở những bệnh nhân có nồng độ TG > 200 mg/dL hay > 2,26 mmol/L. Non-HDL-C đƣợc tính theo công thức sau: non-HDL-C = TC – (HDL-C) [92]. Non-HDL-C phản ánh đƣợc toàn bộ lƣợng cholesterol huyết thanh đƣợc vận chuyển bởi tất cả các LP có khả năng gây XVĐM (LDL, VLDL, IDL, và các LP tàn dƣ). Non-HDL-C cũng đƣợc tính toán dễ dàng từ các thông số lipid máu, do đó không tăng thêm chi phí xét nghiệm. Nồng độ non-HDL-C có thể đƣợc định lƣợng ngay cả với những trƣờng hợp không nhịn đói, ngƣợc lại với định lƣợng LDL-C đòi hỏi phải nhịn đói [106].
Với những ƣu điểm đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chỉ số non- HDL-C thay thế cho LDL-C để đánh giá mức độ RLLPM của chuột nhắt trắng cũng nhƣ đánh giá hiệu quả điều trị của thuốc thử đối với tình trạng tăng cholesterol máu. Tình trạng RLLPM do P-407 gây ra trên chuột nhắt chƣa hoàn toàn giống với tình trạng RLLPM trên ngƣời. Tình trạng RLLPM trên ngƣời đƣợc đặc trƣng bởi tăng nồng độ cholesterol (LDL-C và TG) và giảm nồng độ HDL-C trong máu. Kết quả gây RLLPM nội sinh bằng P-407 trên chuột nhắt lại cho thấy tăng cả nồng độ HDL-C so với nhóm chứng (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p ≤0,001). Kết quả này có thể đƣợc giải thích bằng việc đi sâu vào tìm hiểu cơ chế gây RLLPM của P-407.Cơ chế gây RLLPM của P-407 đã đƣợc chứng minh: ức chế các enzym lipoprotein lipase (LPL) huyết tƣơng [78], cholesterol 7α-hydroxylase (C7αH) [77]; tăng số lƣợng và hoạt động của 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG- CoA) reductase, giảm số lƣợng LDL receptor (LDLr) tại gan [85]. Đặc biệt, Wasan và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tìm hiểu cơ chế gây RLLPM của P-407 trên chuột cống bằng cách tiêm màng bụng P-407 liều 1 g/kg và nhận thấy: ngoài khả năng ức chế LPL, P-407 còn ức chế hoạt động của hepatic lipase (HL) và kích thích hoạt động của lecithin cholesteryol acyl transferase (LCAT) [108]. Cùng với LPL, HL là một enzym khác liên quan đến quá trình chuyển hóa TG. HL chủ yếu thủy phân phospholipid và TG của một số nhóm lipoprotein: CM tàn dƣ, IDL và HDL [59]. LCAT là enzym chịu trách nhiệm chuyển cholesterol thành cholesterol ester trên bề
mặt của các phân tử HDL [56]. Chính sự thay đổi hoạt động của LCAT và HL do P- 407 gây ra có thể ảnh hƣởng đến nồng độ HDL-C. Tác dụng kích thích hoạt động của LCAT của P-407 làm cho quá trình chuyển cholesterol thành cholesterol ester trên bề mặt các phân tử HDL mới sinh (nascent HDL) diễn ra nhanh hơn, làm tăng nồng độ HDL trƣởng thành giàu cholesterol ester. Thêm vào đó, P-407 ức chế hoạt động của HL cũng là một yếu tố kích thích làm tăng nồng độ của HDL-C [72].
Với việc giảm liều P-407 đã cho thấy mức tăng vừa phải của các thông số TC và non-HDL-C (gấp khoảng 3 lần so với nhóm chứng), đồng thời chuột đƣợc uống atorvastatin và SAD kéo dài 7 ngày trƣớc khi gây mô hình RLLPM, vì vậy có thể nhận thấy sự thay đổi rõ rệt của nồng độ TC và non-HDL-C ở các lô uống atorvastatin và uống SAD (Bảng 3.2). SAD ở cả hai liều đều làm giảm có ý nghĩa thống kê các chỉ số TC, non-HDL-C so với lô mô hình (p ≤ 0,05).Nhƣ vậy, SAD đã thể hiện tác dụng điều chỉnh RLLPM khá tốt trên mô hình gây RLLPM nội sinh bằng P-407.
Qua việc tìm hiểu tác dụng đơn độc trên chuyển hóa lipid của của hai dƣợc liệu trong chế phẩm SAD, là cơ sở để giải thích phần nào đó tác dụng điều chỉnh RLLPM của chế phẩm:
- Nghiên cứu của Phạm Tuấn Anh về tác dụng hạ cholesterol máu trên thỏ trong mô hình gây tăng cholesterol nội sinh bằng Tween 80 nồng độ 20% trong dung dịch nƣớc muối đẳng trƣơng với liều 2,5 ml/kg, cho thấy giảo cổ lam (dịch chiết trong cồn 70%, thu hồi dung môi ở áp suất giảm, cắn sấy khô rồi tán thành bột mịn) liều 500 mg/kg/ngày làm giảm cholesterol 32,1% so với lô chứng (p<0,05). Những thành phần có hoạt tính trên chuyển hóa lipid đƣợc báo cáo là Gynosaponin E, G, K, progypenosid A2, I,J,M,N và O [2].
- Hwang và cộng sự (2006) đã chứng minh dịch chiết rễ chóc máu làm giảm cholesterol toàn phần, và triglycerid huyết tƣơng, giảm triglycerid gan và acid béo no không ester hóa, giảm tỷ lệ hạt lipid trong mô của gan trên chuột ĐTĐ béo phì Zuker. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết chóc máu làm tăng tuần hoàn lipid gan bằng cách hoạt hóa PPARα [80]. Mangiferin trong dịch chiết rễ chóc máu
đƣợc chứng minh có tác dụng làm giảm nồng độ lipid máu trên động vật gây đái tháo đƣờng typ 2.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});