Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các dòng vi- 123docz.net

5 DAI 10 DAI 1 DAI 20 DAI Trung bình 4 đợt đo

3.6.Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô đã được tuyển chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA

ngô đã được tuyển chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA

Qua kết quả định lượng thu được, có 13 dòng được tuyển chọn cho các thí nghiệm để nhận diện và định danh tiếp theo. Các dòng này có kết quả định lượng ammonia hoặc phosphate hòa tan cao (Bảng 3.11).

Bảng 3.11: Nồng độ ammonium (NH4+), lân hữu dụng (P2O5) của 13 dòng vi khuẩn vùng rễ cây ngô trồng trên đất đất xám của tỉnh Tây Ninh

Nguồn gốc

(Môi trường phân lập)

Tên dòng vi khuẩn NH4+ P hữu dụng (P2O5) (mg/L) Burk không N TĐB01 0,80 a 28,17 mn TĐB03 0,61 bcd 33,07 kl TĐB08 0,72 abc 26,25 n TĐB09 0,60 cd 39,53 h TĐB13 0,74 abc 70,93 c NBRIP TĐN02 0,50 abcdef 38,35 h TĐN04 0,54 abcde 47,04 d TĐN06 0,61 ab 57,79 c TĐN09 0,58 abcd 87,54 a TĐN11 0,59 abc 82,35 b

TĐN19 0,47 abcdefg 33,08 i

TĐN24 0,67 a 39,76 gh

TĐN27 0,64 a 43,37 efg

Các chữ cái giống nhau theo sau số liệu chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa ở mức P=0,05 (theo test LSD và Duncan)

DNA của 13 dòng vi khuẩn được tuyển chọn được ly trích theo protocol của Neumann và ctv. (1992). Phản ứng khuếch đại 16S rDNA bằng PCR được thực hiện với cặp mồi chung 8F và 1492R (Turner et al., 1999). Điện di sản phẩm PCR (16S rDNA 1485 bp) trên gel agarose 1,2% của các dòng này đều cho band ở khoảng 1500 bp so với thang chuẩn 100 bp (hình 3.12).

Hình 3.12: Điện di sản phẩm PCR 16S rDNA

của một số dòng vi khuẩn vùng rễ cây ngô trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh (M: 100 bp DNA Bio Ladder; ĐC: đối chứng âm)

Các sản phẩm khuếch đại bằng PCR được thu nhận, tinh sạch và giải trình tự. Kết quả dò tìm các trình tự gene 16S rRNA tương đồng của các chủng có trong cơ sở dữ liệu của GenBank (NCBI) cho thấy 13 dòng đã chọn lọc tương đồng với các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus, Burkholderia, Achromobacter và

Brevibacterium. Đây là các chủng vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật đã được báo cáo từ nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Bzazil, Hoa Kỳ, v.v… Các chủng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm hoặc hòa tan phosphate. Một số dòng được phân lập từ vùng rễ (ví dụ KF782832), nội sinh

trong cây (FJ493039), thậm chí cộng sinh với cây họ Đậu (KF879923). Một số dòng có tiềm năng sản xuất phytohormone (JN639877) hoặc kháng bệnh (KC172004). Mức độ đồng hình giữa 13 dòng đã tuyển chọn với các chủng nói trên đạt 96 – 99%.

Hình 3.13: Cây phả hệ cho thấy vị trí tương đối của các PGPB được xây dựng dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp neighbor-joining.

Chỉ số bootstrap trên 1000 lần lặp lại được thể hiện ở các node của cây.

Hình 3.13 trình bày cây phả hệ của 13 dòng đã được tuyển chọn cùng với các chủng đồng hình có trong cơ sở dữ liệu của NCBI. Cây phả hệ này chia thành hai cụm. Cụm A với 14 dòng bao gồm hai cụm nhỏ hơn là A1 và A2. Cụm A1 có 12 dòng tương đồng chủ yếu với các chủng Bacillus spp. Riêng Achromobacter xylosoxidans ASU10 cùng cụm với Bacillus subtilis FMG-3 với độ tin cậy 66%. Cụm A2 với 2 dòng, trong đó TĐN19 cùng nguồn gốc với Brevibacterium sp. JS- C50, một vi khuẩn liên hiệp thực vật phân lập từ Ấn Độ với bootstrap 100% trên 1000 lần lặp lại. Cụm B1 Cụm B2 Cụm B Cụm A1 Cụm A2 Cụm A

Cụm B gồm 12 dòng, chia làm 2 cụm nhỏ B1 và B2. B1 gồm các vi khuẩn chung nhánh với các Achromobacter xylosoxidans có khả năng cố định đạm và B2 gồm những nhánh quan hệ gần gũi với các Burkholderia spp. kích thích tăng trưởng thực vật thông qua cố định đạm hay sản xuất IAA.

Bảng 3.12: Tóm tắt nguồn gốc và mức độ đồng hình giữa 13 dòng tuyển chọn với các chủng tương đồng có trong cơ sở dữ liệu của NCBI

STT Dòng Dòng vi khuẩn Nguồn gốc Số nucleotide giải được (bp) Dòng vi khuẩn đồng hình Mức độ đồng hình (%) 1 TĐB01 Gia Bình, Trảng Bàng 1189 Bacillus sp. 99 2 TĐB03 Cẩm Giang,

Gò Dầu 1269 Bacillus subtilis 99

3 TĐB08 Cẩm Giang,

Gò Dầu 1124 Bacillus tequilensis 98

4 TĐB09 Gia Bình, Trảng Bàng 1406 Bacillus methylotrophicus 98 5 TĐB13 Thạnh Đông, Tân Châu 1222 Achromobacter xylosoxidans 98 6 TĐN02 Gia Bình, Trảng Bàng 1102 Achromobacter xylosoxidans 99 7 TĐN04 Cẩm Giang,

Gò Dầu 1208 Bacillus subtilis 99

8 TĐN06 Bình Minh,

thị xã Tây Ninh 1040 Burkholderia sp. 98 9 TĐN09 Gia Bình,

Trảng Bàng 1266 Burkholderia vietnamiensis 99 10 TĐN11 Gia Bình,

Trảng Bàng 1280 Burkholderia metalica 99 11 TĐN19 Truông Mít, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Dương Minh Châu 1068 Brevibacterium sp. 97 12 TĐN24 Truông Mít,

Dương Minh Châu 1320 Bacillus subtilis 99 13 TĐN27 Trà Vong,

Dựa vào trình tự gene 16S rRNA của 13 dòng này, cây phả hệ đã được thiết lập như hình 3.14 bên dưới.

Hình 3.14: Cây phả hệ của 13 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô được xây dựng dựa trên trình tự gene 16S rRNA bằng phương pháp neighbor-joining.

Chỉ số bootstrap trên 1000 lần lặp lại được thể hiện ở các node của cây.

Hình 3.14 thể hiện cây phát sinh loài riêng của 13 dòng vi khuẩn đất vùng rễ đã được tuyển chọn. Cây được phân thành 2 cụm. Cụm thứ nhất gồm 6 dòng (TĐB09, TĐN24, TĐB03, TĐB01, TĐB08 và TĐN04) đồng hình với Bacillus

spp. và 1 nhánh riêng biệt gồm TĐN19 đồng hình với Brevibacterium sp.; cụm thứ hai gồm hai cụm nhỏ. Cụm Burkholderia với 3 dòng TĐN09, TĐN11, TĐN06 và cụm Achromobacter xylosoxidans với 3 dòng TĐN07, TĐB13 và TĐN02. Các vi khuẩn thuộc các chi Rhizobium và Agrobacterium (α-Proteobacteria);

Burkholderia và Achromobacter (β-Proteobacteria); Pseudomonas, Aerobacter và

Erwinia (-Proteobacteria); Microccocus (Actinobacteria); Bacillus (Firmicutes) và Flavobacterium (Bacteroidetes) đã được báo cáo là có khả năng hòa tan các phosphate khoáng như tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyl apatite và phosphate đá (Goldstein, 1986; Rodríguez and Fraga, 1999; Rodríguez et al., 2006). Trong đó Pseudomonas, Bacillus và Rhizobium là những vi khuẩn hòa tan phosphate mạnh nhất. Kết quả giải trình tự 13 dòng vi khuẩn đất vùng rễ

Bacillus spp. Brevibacterium sp. Cụm 1 Burkholderia spp. Achromobacter sp. Cụm 2

ngô có khả năng hòa tan phosphate (cũng như cố định đạm) cho thấy phần lớn các dòng tương đồng với Burkholderia spp và Bacillus spp. trong đó có Bacillus megaterium vốn là loài được sử dụng làm chế phẩm “Phosphobacterin” bổ sung lân cho cây trồng ở Liên Xô cũ và Ấn Độ (Kumar and Pathak, 2000).

Kết quả nghiên cứu PGPR ở ngô của Picard và ctv. (2000) chủ yếu tập trung vào các Pseudomonad huỳnh quang nhưng các nghiên cứu của Di Cello và ctv. (1997) và của Dalmastri và ctv. (1999) đã tìm thấy các quần thể hiện diện trong đất vùng rễ ngô trong các giai đoạn phát triển khác nhau chính là Burkholderia cepacia. Mức đa hình cao của các dòng B. cepacia phân lập được trong các giai đoạn phát triển sớm của cây ngô đã được báo cáo (Di Cello et al., 1997) và một độ đa dạng cao giữa các quần thể B. cepacia phân lập từ đất vùng rễ ngô trồng trên các loại đất khác nhau cũng đã được phát hiện (Dalmastri et al., 1999). Trong nghiên cứu vi khuẩn đất vùng rễ ngô trồng trên đất xám của tỉnh Tây Ninh, sự hiện diện của chi Burkholderia và Achromobacter (β-Proteobacteria) Gram âm có vẻ phong phú hơn so với các Bacillus (Firmicutes) và Brevibacterium (Actinobacteria) Gram dương. Đặc biệt cũng đã tìm thấy loài Burkholderia vietnamiensis, vốn đã được phân lập từ đất trồng lúa ở Đồng bằng sông Cửu Long (Ngô Thanh Phong và ctv., 2011) và từ đất vùng rễ cây ngô trồng trên đất đen của tỉnh Đồng Nai (Đặng Thị Ngọc Thanh và Cao Ngọc Điệp, 2012). Loài này có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cũng như có khả năng phân giải kali nên đã được phát triển thành chế phẩm phân bón DASVILA dùng cho cây lúa ở Việt Nam (Cao Ngọc Điệp và Đào Thị Đẹp, 2011; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Mộng Tuyền (2011).

Gần đây, kết quả nghiên cứu của Gronemeyer và ctv. (2012) trên vi khuẩn đất vùng rễ của các loại cây trồng ở Kavango, Namibia, trong đó có cây ngô, cho thấy sự hiện diện chủ yếu của Proteobacteria, Firmicutes và Actinobacteria. Kết quả này tương tự như kết quả thu được của Zinniel và ctv. (2002) trên vi khuẩn nội sinh phân lập được từ ngô và sorghum trồng ở Nebraska, Hoa Kỳ, trong đó số lượng các dòng phân lập được thuộc Gram âm và thuộc Gram dương là tương đương nhau. Trong nghiên cứu này, như đã đề cập số dòng vi khuẩn Gram âm

(70,9%) thu được nhiều hơn so với các dòng Gram dương (29,1%). Cuối cùng, sự phát hiện nhiều dòng tương đồng với Bacillus spp., một loại vi khuẩn có khả năng sinh nội bào tử, tỏ ra phù hợp với tính chất ẩm độ thấp của đất xám và tập quán sử dụng nước mưa là chủ yếu của nông dân địa phương. Điều này cũng tương tự như sự phát hiện của Heulin và ctv. (2003) về các vi khuẩn sinh nha bào Ramlibacter

Chương IV

Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô đã được tuyển chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA

5 DAI 10 DAI 1 DAI 20 DAI Trung bình 4 đợt đo

3.6.Mối quan hệ phát sinh chủng loại giữa các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô đã được tuyển chọn dựa trên trình tự gene 16S rRNA

Mục lục