L ời cam đoan
2.4.9. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo đường kính vòng
thủy phân
a. Nguyên tắc
Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzyme của VK phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt xung quanh KL. Độ lớn của vòng trong suốt thể hiện hoạt tính của enzyme.
b. Tiến hành
Phương pháp cấy chấm điểm
− Chuẩn bị các chủng VK cần nghiên cứu và MT định tính khả năng sinh enzyme cellulase (MT2).
− Cấy chấm điểm các chủng VK lên bề mặt môi trường (3 điểm/ đĩa).
− Ủ các đĩa petri trong tủ ấm 300
C trong 24 giờ. Sau đó, đo đường kính vòng phân giải.
Phương pháp này chỉ sơ bộ định tính enzyme.
Phương pháp khoan lỗ thạch [1]
− Chuẩn bị các đĩa petri có MT định tính enzyme (MT2). Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính enzyme, dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1ml dịch enzyme vào các lỗ khoan.
− Giữ các đĩa petri trong tủ lạnh 40C trong 8h, sau đó chuyển ra nhiệt độ phòng 24h.
− Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải.
c. Kiểm tra kết quả
Dùng lugol nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu VK sinh ra cellulase có 1 vòng trong suốt quanh lỗ khoan do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với lugol.
Khả năng sinh cellulase được đánh giá bằng hiệu số D-d (D: đường kính vòng phân giải, d = 9 mm: đường kính của lỗ khoan).
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) (D – d) ≥ 25mm: enzyme có hoạt tính rất mạnh (D – d) = 20-24,5 mm: enzyme có hoạt tính mạnh (D – d) = 10-19,5 mm: enzyme có hoạt tính trung bình (D – d) ≤ 10mm: enzyme có hoạt tính yếu