Lá khoai lang được sấy khô ở nhiệt độ 60-650C, nghiền nhỏ. Ngâm bột khô lá khoai lang với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần. Sau đó lọc bằng giấy lọc và cất loại dung môi với áp suất giảm thu được cao phân đoạn ethanol. Cao ethanol sau khi hòa tan lại trong nước cất nóng được chiết qua hệ các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan → chloroform → ethylacetate. Cất loại dung môi từ các phân đoạn dịch chiết thu được cao các phân đoạn.
2.2.2. Định tính một số nhóm hợp chất thiên nhiên của lá khoai lang
Để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong lá rau khoai lang chúng tôi tiến hành thực hiện một số thí nghiệm định tính với thuốc thử. Mẫu thử được pha trong EtOH và chia vào các ống nghiệm.
2.2.2.1. Định tính flavonoid
+ Phản ứng Shinoda: Chuẩn bị ống nghiệm có chứa mẫu phản ứng, thêm một ít bột Mg, nhỏ thêm vài giọt acid HCl đặc sau đó đun sôi trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng này cho kết quả dương tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
+ Phản ứng với sunfuric acid: các flavonoid phản ứng với sunfuric acid đặc sẽ cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
+ Phản ứng định tính catechin: Nhỏ dung dịch mẫu lên giấy lọc, thêm dung dịch vanilin trong HCl đặc. Nếu kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
2.2.2.2. Định tính tannin
+ Phản ứng với vanilin: thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu đỏ đậm.
+ Phản ứng với gelatin/NaCl: thêm vài giọt thuốc thử gelatin/NaCl vào ống thí nghiệm. Phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
+ Phản ứng với acetate chì: thêm vài giọt dung dịch acetate chì 10%. Phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện kết tủa.
2.2.2.3. Định tính alkaloid
Mẫu thử được pha trong dung dịch acetic acid 2%
+ Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch acid HCl): Alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm khi phản ứng với thuốc thử Bouchardat
+ Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong H2O): Alkaloid phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
+ Phản ứng với thuốc thử Dragendoff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acetic acid): Alkaloid phản ứng với thuốc thử Dragendoff cho dung dịch màu vàng da cam đến đỏ.
2.2.2.4. Định tính glycoside
Phản ứng Keller-Killian: Chuẩn bị các dung dịch thuốc thử gồm Dung dịch A: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml acetic acid 10%. Dung dịch B: 0.5ml dung dịch FeCl3 5% trong 50ml sunfuric acid đặc. Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch A vào lắc cho tan hết rồi nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.5. Định tính các polyphenol khác
+ Phản ứng với dung dịch kiềm: Các polyphenol khi phản ứng với dung dịch kiềm cho kết quả màu vàng.
+ Phản ứng với FeCl3: Thêm dung dịch FeCl3 trong HCl 0.5N vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu. Phản ứng dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.3. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau [ 12] Ciocalteau [ 12]
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. Đo độ hấp phụ của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 765nm. Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo mg acid gallic chuẩn.
Hóa chất: Dung dịch gallic acid: 0,5g acid galic + 10ml EtOH 96% + 90ml H2O cất 2 lần); Dung dịch Na2CO3 20%; thuốc thử Folin - Ciocalteau.
Phương pháp: Xây dựng đường chuẩn acid gallic bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l.
Chuẩn bị cóng định lượng, cho vào mỗi cóng 20µl mẫu hoặc dung dịch chuẩn + 1.58ml nước + 100µl thuốc thử Folin-Ciocalteau + 300 µl dung dịch Na2CO3.
Cách đo với dịch nghiên cứu: tiến hành như trên nhưng thay 0,02ml (20l) dịch chuẩn bằng dịch nghiên cứu được pha loãng thích hợp sao cho số đo nằm trong đường chuẩn.
2.2.4. Sắc ký lớp mỏng [3]
Nguyên tắc: Sắc kí lớp mỏng là một phương pháp dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất có trong mẫu nghiên cứu một cách nhanh chóng, dễ dàng. Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau trong mẫu nghiên cứu với pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) và pha tĩnh (bản mỏng). Pha tĩnh thường sử dụng là silicagel, Al2O3, cellulose, polyamide…
Phương pháp: Sử dụng bản Silicagel 60 F254 tráng sẵn với kích thước bản sắc kí là 20x20 cm. Các mẫu thí nghiệm được pha trong các dung môi thích hợp sau đó chấm mẫu vào bản sắc kí cách đáy 1,5 cm và tiến hành chạy trong pha động là hệ dung môi Toluen: ethylacetate: aceton: acid formic (5:3:1:1). Sau khi chạy xong tiến hành nhuộm bản sắc kí bằng các thuốc thử và xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.
2.2.5. Định lượng triglyceride huyết thanh theo phương pháp enzyme
Nguyên lý: thủy phân triglyceride bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng bằng phương pháp đo màu của quinoneimin tạo thành từ 4- aminoantipyrine và 4-chlorophenol phản ứng với hydrogen peroxide theo các phản ứng:
Triglyceride Lipase Glycerol + acid béo
Glycerol + ATP GK
Glycerol 3-phosphate + ADP
Glycerol 3-phosphate + O2 GPO Dihydroxyacetonphosphate + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipyrine + 4-chlorophenol POD Quinoneimine +HCl +4H2O
Trong đó GK là glycerolkinase, GPO là glycerol-3-photphatoxidase, POD là peroxidase.
Kết quả: đo mức độ quang học quinoneimine ở bước sóng 546nm rồi so sánh với chuẩn.
2.2.6. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh theo phương pháp enzyme
Nguyên lý: Thủy phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase theo các phản ứng:
Cholesterol este + H2O CHE Cholesterol + acid béo
Cholesterol + O2
CHO
Cholesterol-3-one + H2O2
2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol POD Quinonimin + H2O
Kết quả: so mật độ quang học của quinonimin với chuẩn.
2.2.7. Phương pháp nuôi chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt chủng Swiss 4 tuần tuổi cân nặng trung bình ban đầu 18g/con được nuôi trong các điều kiện giống nhau về thời gian và không gian nhưng với hai chế độ thức ăn khác nhau. Lô đối chứng cho ăn thức ăn chuẩn của Viện vệ sinh dịch tễ TW, lô thí nghiệm cho ăn thức ăn giàu lipid.
Sau 2 tuần chúng tôi tiến hành cân trọng lượng trung bình và xác định một số chỉ số mỡ máu của các lô chuột thí nghiệm, từ đó so sánh mức độ tăng trọng và các chỉ số mỡ máu của các lô chuột được nuôi theo hai chế độ thức ăn khác nhau kể trên.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HÓA SINH CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ KHOAI LANG (Ipomoea batatas CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ KHOAI LANG (Ipomoea batatas
Poir.)
3.1.1. Quy trình tách chiết
Để khảo sát thành phần hóa học của lá khoai lang chúng tôi sử dụng ethanol 90% chiết rút thu được cao ethanol. Phân bố đều cao ethanol trong nước cất, sau đó chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetate. Các dịch chiết tương ứng được cất loại dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform, ethylacetate và phân đoạn nước. Quy trình chiết rút được mô tả ở hình 3.1.
Từ 3 kg bột lá khoai lang khô được ngâm kiệt 3 lần trong ethanol 90%, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 210g. Giữ lại 50g dùng cho quá trình phân tích và điều trị cho chuột, khối lượng cao cồn còn lại (160g) dùng để tách chiết qua các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua các dung môi của lá khoai lang Hoàng long được trình bày ở bảng 3.1.
Bột lá khoai lang
Cao ethanol
Phân lớp n-hexan Phân lớp nước
Phân lớp nước
Phân lớp ethylacetate Phân lớp nước Phân lớp chloroform
Cao PĐ ethylacetate Cao PĐ nước
Ngâm với ethanol 90%, lọc, cất loại dung
môi dưới áp suất giảm (chiết 3 lần)
Cô loại dung môi
Chiết ethylacetate Chiết chloroform
Bổ sung nước, chiết n-hexan
Cô loại dung môi
Cô loại dung môi Cao PĐ n-hexan
Cao PĐ chloroform
Bảng 3.1. Khối lượng mẫu thu được khi chiết qua các phân đoạn
Khoai lang Hoàng Long Mẫu
Các PĐ
Mẫu ban đầu (g) Mẫu khô tuyệt đối (g)
Hiệu suất chiết rút (%) EtOH 170 20,54 12,08 n-Hexan 34,20 1,32 3,85 Chloroform 6,05 0,075 1,23 Ethylacetate 14,95 0,540 3,61 PĐ nước 75,6 8,45 11,17
3.1.2. Kết quả định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết lá khoai lang đoạn dịch chiết lá khoai lang
Để xác định thành phần hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết các phân đoạn của hai giống khoai lang đã cô thành cao gồm có: Cao EtOH, n- hexan, CHCl3, EtOAc, PĐ nước. Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết lá khoai lang
Phân đoạn Nhóm
chất
Phản ứng
đặc trưng EtOH n-hexan CHCl3 EtOAc H2O Shinoda + + - ++ + Diazo ++ + ++ +++ + NaOH 10% + + + ++ + Flavonoid H2SO4 + + - ++ - Vanillin + - - + - FeCl3/HCl ++ + + ++ + Gelatin ++ + + ++ + Tanin Acetate chì ++ + + ++ + Dragendorf + + + + + Mayer + - + + - Alkaloid Bouchardat + - + + + Glycoside Keller-Kilian ++ + + +++ + Saponin Tạo bọt + + + + + Ghi chú: (+): Chỉ các mức độ phản ứng; (-): Phản ứng âm tính.
Từ kết quả các phản ứng định tính cho thấy thành phần các hợp chất tự nhiên trong lá khoai lang khá phong phú bao gồm: Flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid và saponin. Cao của cả 4 phân đoạn EtOH, n-hexan, CHCl3 và EtOAc đều chứa các thành phần này nhưng với hàm lượng khác nhau. Căn cứ vào mức độ phản ứng cho thấy cao phân đoạn EtOAc phản ứng với các thuốc thử nhận biết flavonoid, tannin và alkaloid mạnh hơn so với phản ứng nhận biết saponin đồng thời mạnh hơn phản ứng của các cao phân đoạn khác. Như vậy, cao phân đoạn EtOAc chứa hàm lượng các chất tự nhiên lớn và phong phú nhất. Tiếp theo là phân đoạn EtOH và CHCl3. Phân đoạn n- hexan chứa ít các hợp chất tự nhiên hơn, cuối cùng là cao phân đoạn nước.
3.1.3. Phân tích thành phần hóa học trong các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc kí bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua thăm dò chúng tôi thấy hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) hay (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic) là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn.
Kết quả sắc ký đồ hình 3.2. cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau. Trong sắc ký lớp mỏng, các chất có độ phân cực mạnh hơn và có khối lượng phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn lên phía trên và có hệ số Rf lớn. Và ngược lại, các chất có độ phân cực yếu, khối lượng phân tử lớn sẽ chạy chậm hơn và có hệ số Rf nhỏ. Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn dịch chiết đều cho nhiều băng vạch với nhiều màu sắc, các băng vạch nằm gối lên nhau. Màu sắc các băng vạch gồm các màu chủ yếu như: Màu vàng (đặc trưng cho flavonoid), màu tím (đặc trưng của tecpen), màu xanh (đặc trưng của diệp lục) chứng tỏ trong các phân đoạn dịch chiết từ lá khoai lang chứa thành phần
1 2 3 4 5 6
Hình 3.2. Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết lá khoai lang
Ghi chú:
1- Cao EtOH 2- Cao n-hexan 3- Cao CHCl3 4- Cao EtOAc
5- Cao phân đoạn nước 6- Chất chẩn (Reerceten)
polyphenol khá phong phú. Phân đoạn nước có ít băng vạch nhất. Phân đoạn EtOAc, phân đoạn EtOH cho các băng đậm với các màu tím, nâu đỏ, vàng nhạt và xanh. Như vậy cho thấy phân đoạn EtOAc và cao cồn tổng số chiếm lượng polyphenol nhiều nhất.
3.1.4. Hàm lượng polyphenol tổng số trong cao dịch chiết các phân đoạn
3.1.4.1. Xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 50, 100, 150, 250, 500mg/l, tiến hành so màu trên máy ERMA ở bước sóng nm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả đường chuẩn gallic
STT Acid gallic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
3.1.4.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau
Định lượng polyphenol của dịch chiết các phân đoạn bằng phương pháp Folin - Ciocalteau. Dịch chiết mẫu cho phản ứng với thuốc thử Folin - Ciacalteau tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy ERMA ở bước
Hình 3.3. Đồ thị chuẩn acidgallic
Đ? th? chu?n acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 6 5 n m y = 0.001x + 0.0128
sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic để tính lượng polyphenol. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số trong các PĐ dịch chiết
Mẫu PĐ OD765nm Tỷ lệ (%) EtOH 0,532 5,192 n-hexan 0,304 2,192 EtOAc 0,578 6,552 CHCl3 0,314 3,012 PĐ nước 0,122 1,098
Kết quả bảng 3.4. cho thấy hàm lượng polyphenol trong phân đoạn cao EtOAc là nhiều nhất chiếm 6,5-8%, tiếp đó là phân đoạn EtOH (khoảng 5 %). PĐ n-hexan và PĐ nước có hàm lượng hợp chất này thấp, lần lượt là 1,02% và 1,098%.
3.2. TẠO MÔ HÌNH CHUỘT BP THỰC NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CHỐNG RỐI LOẠN TRAO ĐỔI LIPID CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT
3.2.1. Tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Qua tham khảo [13] và thử nghiệm chúng tôi đã thành công trong việc tạo mô hình chuột béo phì thực nghiêm bằng cách cho chuột ăn thức ăn giàu lipid, cholesterol với thành phần được thể hiện ở bảng 3.5. Khi sấy khô chúng tôi có bổ sung thêm một lượng lớn cholesterol trong lòng đỏ trứng gà và lượng lipid trong mỡ lợn.
Bảng 3.5. Thành phần thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao
Chuột được lựa chọn có trọng lượng từ 18-20g (4 tuần tuổi) được phân lô mỗi lô 10 con và nuôi tiếp 4 tuần với chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao, lô đối chứng ăn thức ăn tiêu chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Sau 4 tuần nuôi theo chế độ ăn như trên, chúng tôi thấy có sự khác nhau rõ rệt về khối lượng của chuột nuôi bằng thức ăn giàu lipid so với chuột nuôi bằng chế độ ăn thường. Kết quả được thể hiện ở biểu đồ hình 3.5.
Thành phần Hàm lượng (%) Hydatcacbon 30 Cazein 25 Cholesterol 10 Lipid 20 Vitamin 5 Chất khác 10
Hình 3.4. Hình ảnh chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng
Chuột nuôi béo
Từ biểu đồ hình 3.5. cho thấy:
Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về trọng lượng không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Trong 7 ngày đầu tiên, khi nuôi với chế độ thức ăn giàu lipid trọng lượng chuột đã tăng có ý nghĩa thống kê toán học (P < 0,01).
