6. Xác định hoạt tính phân giải Urea
4.2.1.Chiều cao cột khí CO2 ở ống Durham
Bảng 8 . Chiều cao cột khí CO2ởống Durham (cm) của 10 NT theo thời gian (giờ) lên men rượu
* Ghi chú: “-” Chiều cao cột khí CO2 không thay đổi. Chiều cao cột khí là trung bình của 3 lần lặp lại.
Kết quả khảo sát cho thấy dòng HGC3 phân lập từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh có hoạt lực lên men mạnh nhất nên có thời gian đẩy hết ống Durham sớm nhất (16 giờ) so với các dòng nấm men phân lập khác và dòng nấm men đối chứng (dòng 2.1). Trong quá trình lên men rượu có sản phẩm chính là ethylic và CO2, để xác định hoạt lực lên men của nấm men có thể dựa trên khả năng thoát khí CO2 trong quá trình lên men (Nguyễn Đức Lượng et al, 2003). Vì vậy, có thể dựa vào thời gian đẩy hết ống Durham sớm nhất, để xác định dòng nấm men HGC3 là dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất. Tuy nhiên, do thời gian lên men trong ống Durham quá ngắn (40 giờ) trong khi quá trình lên men rượu có thời gian dài hơn (10 ngày), vì vậy phương pháp đo chiều cao cột khí CO2 trong ống Durham chỉ là cơ sở ban đầu để xác định dòng
Thời gian lên men (giờ)
NT 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 33 36 40 2.1 0,1 0,4 0,7 1,2 2,7 2,9 3 - - - - HGC3 - 0,2 0,5 1,1 2,8 3 - - - - DGC1 - 0,3 1,4 2,2 2,7 3 - - - - DGC2 - - - - 0,1 0,2 0,2 0,3 0,5 1,2 1,6 1,9 2 2,4 2,7 3 DCL1 - 0,2 0,4 0,8 1,2 1.7 2 2,4 2,5 2,8 3 - - - - - DCL2 - - - - 0.1 0.3 0,6 0,6 0,6 1,1 1,5 1,8 2,3 2,3 2,5 2,8 HBT1 - - - - 0.1 0,2 0,2 0,2 0,2 1,2 1,3 1,8 2 2,2 2,6 2,7 HBT3 - - - - 0,2 0.4 1 1,4 1,8 2 2 2,6 2,9 2,9 3 - HCL4 - - - - 0,1 0,3 0.6 0,9 1,1 1,4 1,7 1,8 2 2,1 2,4 2,5 DBT1 - - - 0,2 0,2 0,2 0,5 0,8 1 1,2 1,8 2,2 2,6
4.2.2. Khả năng lên men của 9 dòng nấm men phân lập và dòng nấm men 2.1 (đối chứng)
Từ kết quả phân tích (Bảng 9) cho thấy dòng nấm men DCL1 lên men cho độ cồn cao nhất (12,14 %v/v) khác biệt có ý nghĩa so với các dòng nấm men khác. Dòng nấm men đối chứng (dòng 2.1) và 2 dòng nấm men HBT1, HBT3 cho độ cồn tương đối cao (11,9 %v/v, 11.92 %v/v và 11,86 %v/v), không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Các dòng nấm men phân lập còn lại cho độ cồn thấp hơn.
Kết quả khảo sát sau quá trình lên men rượu, độ Brix sản phẩm rượu của 10 dòng nấm men đều giảm so với Brix = 24 của dịch lên men phối chế ban đầu và dòng nấm men DCL1 có độ Brix giảm thấp (10,770Brix) không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng nấm men đối chứng (dòng 2.1) với Brix giảm thấp nhất (10,230Brix). Sự giảm độ Brix là do hoạt động của nấm men chúng sử dụng đường làm nguồn carbon chủ yếu để lên men tạo ra sản phẩm rượu.
Bảng 9. Độ brix, pH và độ cồn trung bình của 10 dòng nấm men sau thời gian lên men 10 ngày
STT Dòng nấm men Brix sau lên men pH sau lên men Độ cồn (% v/v)
1 2.1 10,23a 4,17 11,90a 2 HGC3 11,1abc 4,28 11,64ab 3 DGC1 11,07abc 4,07 11,76ab 4 DGC2 12,43cd 4,01 10,18ab 5 DCL1 10,77abc 4,01 12,14a 6 DCL2 12,37cd 4,02 11,24ab 7 HBT1 12,0bcd 3,98 11,92a 8 HBT3 11,73abcd 3,99 11,86a 9 HCL4 12,93d 3,95 9,47b 10 DBT1 10,53ab 4,07 10,84ab CV (%) 8,79 12,18
* Ghi chú: Số liệu trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại. Trong cùng một cột các số có mang số mũ giống nhau thì không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5 % (P < 0,05)
* Ghi chú: là dòng nấm men DCL1 có độ cồn cao nhất (12,14 % v/v) và độ Brix thấp (10,770Brix)
Hình 16. Biểu đồ thể hiện độ Brix và độ cồn của rượu vang sau lên men
Từ kết quả của phương pháp đo chiều cao cột khí Durham và khả năng lên men
của 10 dòng nấm men ta thấy có sựkhông đồng nhất. Dựa vào Độ cồn của 3 lần lặp lại (phụ lục) cho thấy ở nghiệm thức (HGC3: 10,77; 13,28; 10,88) có sự biến động nhiều nhất và nghiệm thức (DCL1: 12,65; 12,06; 11,7) có số liệu khá cao và tương đối đồng
đều hơn. Mặt khác, dòng nấm men DCL1 lên men có độ cồn cao nhất (12,14 % v/v) và
độ Brix giảm thấp (10,770Brix) không khác biệt có ý nghĩa thống kê 95 % so với dòng nấm men đối chứng (dòng 2.1) có độ Brix giảm thấp nhất (10,230Brix). Và do đó,
nghiệm thức DCL1 là dòng nấm men được chọn cho thí nghiệm tiếp theo.
Xử lý số liệu và tính kết quả theo phương pháp thống kê Anova bằng phần mềm Statgraphics plus 4.0. 0 2 4 6 8 10 12 14 2.1 HG C3 DG C1 DG C2 DC L1 DC L2 HBT1 HBT3 HC L4 DBT1 brix cồn
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix, pH và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao từ dòng nấm men DCL1
Kết quả khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu vang ca cao: pH ban đầu (3,5; 4; 4,5), độ Brix ban đầu (24; 26; 28) và mật số nấm men (103,105, 107 tế bào/ml) sau thời gian lên men 10 ngày được thể hiện ở bảng 10
Bảng 10. Độ cồn, brix, pH sau lên men 10 ngày từ dòng nấm men DCL1
NT Tổ hợp Brix – pH – MSNM pH Brix Độ cồn % (v/v) 1 24-3,5-103 3,83 13,75efghi 14,01ab 2 24-3,5-105 3,77 14,75ghij 5,87hij 3 24-3,5-107 3,72 15,75hij 6,00hij 4 24-4-103 4,17 7,5a 14,60a 5 24-4-105 4,28 10abcdef 13,86ab 6 24-4-107 4,17 8ab 14,07ab 7 24-4,5-103 4,25 9,75abcde 10,09cdefg 8 24-4,5-105 4,18 11,25abcdefg 8,87efghi 9 24-4,5-107 4,79 9,25abcd 12,85abcd 10 26-3,5-103 3,75 15,75hij 6,26hij 11 26-3,5-105 3,83 14,5ghij 6,96ghi 12 26-3,5-107 3,67 17,75ijk 5,53ij 13 26-4-103 4,26 11 abcdefg 11,71abcdef 14 26-4-105 4,22 8,75abc 14,33a 15 26-4-107 4,07 11,75bcdefgh 11,55abcdef 16 26-4,5-103 4,23 13,75efghi 9,34defgh 17 26-4,5-105 3,76 13,25defgh 8,82efghi 18 26-4,5-107 4,23 13,5efgh 9,04efghi 19 28-3,5-103 3,80 21,25kl 6,93ghi 20 28-3,5-105 3,71 23,75l 2,90j 21 28-3,5-107 3,63 18,25jk 13,43abc 22 28-4-103 4,22 12,5cdefgh 13,06abc 23 28-4-105 4,22 11,75 bcdefgh 12,21abcde 24 28-4-107 4,32 11,5 abcdefg 12,71abcd 25 28-4,5-103 4,23 14fghi 10,54bcdef 26 28-4,5-105 4,29 12 bcdefgh 10,72bcdef 27 28-4,5-107 4,18 14fghi 8,39fghi CV (%) 15,39 17,17
* Ghi chú: các số liệu là trung bình của 2 lần lặp lại. Trong cùng một cột các số có mang số
Kết quả phân tích (bảng 10) cho thấy nghiệm thức 4 cho độ cồn cao nhất (14,6 % v/v) không khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức 14 cũng cho độ cồn cao (14.33% v/v) và với 3 nghiệm thức (1, 5, 6) cho độ cồn lần lượt là: 14,01% v/v; 13,86% v/v; 14,07 % v/v.
Kết quả còn cho thấy hàm lượng đường nấm men sử dụng của các mẫu rượu ca cao (bảng 10) ở nghiệm thức 4 (240Brix, pH 4, 103 tế bào/ml) có sự giảm độ Brix nhiều nhất (7,50Brix) và không khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức 6 (240Brix, pH 4, 107 tế bào/ml), nghiệm thức 14 (260Brix, pH 4, 105 tế bào/ml) với sự giảm độ Brix lần lượt là 80Brix; 8,750Brix. Ngoài ra, với điều kiện Brix 24, 26, 28 và pH 3,5 và 4,5 thì các nghiệm thức (2, 3, 10, 11, 12, 8, 16, 17, 18, 27) đều có Brix giảm đáng kể sau lên men nhưng độ cồn khá thấp, còn với pH 4 thì các nghiệm thức (4, 5, 6, 13, 14, 15, 22, 23, 24) thì Brix sau lên men thấp và độ cồn khá cao so với các nghiệm thức khác.
Từ kết quả thu thập được về độ cồn và lượng đường giảm thì nghiệm thức 4 với thông số 240Brix, pH 4 và mật số nấm men 103 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (14,6 % v/v) và độ Brix giảm nhiều nhất (7,50Brix) nên được chọn làm những thông số tốt nhất cho thí nghiệm lên men rượu ca cao.
CHƯƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5.1. Kết luận
Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được dòng nấm men DCL1 trong 18 dòng nấm men đã phân lập, từ mẫu dịch ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách – Bến Tre có hoạt lực lên men cao hơn các dòng nấm men còn lại và cao hơn dòng nấm men 2.1 (đối chứng) với độ rượu là (12,14 % v/v) và độ Brix sau lên men thấp (10,770Brix). Rượu vang ca cao lên men từ nấm men tuyển chọn với dịch phối chế ban đầu: 240Brix, pH 4 và MSNM là 103 tế bào/mL, lên men ở nhiệt độ 300C và 10 ngày cho độ rượu cao nhất (14,6 % v/v).
5.2. Đề nghị
- Tiếp tục các thí nghiệm khảo sát đặc tính và khẳng định hoạt lực lên men mạnh của dòng nấm men DCL1 để ứng dụng lên men rượu vang ca cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bùi Ái. 2008. Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nxb. Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Kiều Hữu Ảnh. 1999. Vi sinh vật học công nghiệp. Nxb. KH&KT Hà Nội. Lương Đức Phẩm.1998. Công nghệ Vi sinh. Nxb. Nông Nghiệp.
Lương Đức Phẩm. 2006. Nấm men công nghiệp. Nxb.KH&KT.
Vũ Công Hậu. 1987. Cây ăn trái miền nam. Nxb. Nông nghiệp Hà Nội.
Nguyễn Xuân Thành. 2005. Giáo trình Vi sinh vật học Công nghiệp. Nxb. Giáo dục. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến. 2006. Giáo trình vi sinh vật học. Nxb. Học
liệu mở Việt Nam.
Nguyễn Đức Lượng. 2002. Công nghệ vi sinh. Nxb. Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thị Phượng Kiều. 2011. Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên dùng sản xuất rượu vang ca cao. Luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Trần Thị Quế và Nguyễn Thị Mỹ Tuyền. 2013. Phân lập, tuyển chọn và định danh nấm men trong lên men rượu vang khóm. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2013: 25b 27-35, Trường Đại học Cần Thơ.
Ngô Thị Phương Dung, Lý Huỳnh Liên Hương và Huỳnh Xuân Phong. 2011. Phân lập, tuyển chọn nấm men và xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lên men rượu vang dưa hấu. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2011:18b 137-145, Trường Đại học Cần Thơ.
Phạm văn Thao, Phan Thanh Bình và ctv. 2011 – 2012. Luận văn Nghiên cứu bổ sung Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men hạt ca cao để nâng cao chất lượng sản phẩm.
Trần Vũ Hồng Liên. 2013. Luận văn tốt nghiệp Nghiên cứu các yêu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu vang ca cao, Trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
Đào Kim Ngọc. 2013. Luận văn tốt nghiệp Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men phục vụ quá trình sản xuất rượu vang từ nước ép thịt quả ca cao,Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu.
Nguyễn Thị Hiền. 2011. Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang nhãn. Luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành công nghệ sinh học,Trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Phúc Trường. 2011. Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên dùng sản xuất rượu vang cam. Luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Trang web
http://vi.wikipedia.org/wiki/Cacao (4/11/2014)
PHỤ LỤC
Phụ luc 1: Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm
Máy Vortex Tủ cấy Tủủ Dàn chưng cất cồn (Thermo) Kính hiển vi Cân phân tích
Phụ lục 2. Phương pháp điều chỉnh độ Brix
Để có được Brix mong muốn, áp dụng công thức các định độ cần cho dịch trái ca cao x x a b 100 100
Tổng lượng đường bổ sung: c = md*10*x Trong đó: a: độ Brix ban đầu
b: độ Brix cần đạt
x: lượng đường bổ sung cho 100 g dịch trái ca cao md: khối lượng dịch trái ban đầu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi thêm đường dùng đũa thủy tinh khuấy từ từ cho tan đường hoàn toàn, kiểm tra lại độ Brix bằng chiết quang kế cầm tay.
Phụ lục 3. Chuẩn bị môi trường
Môi trường tăng sinh:
D – glucose 20 g/l Khoai tây 20g
Môi trường phân lập nấm men:
D – glucose 2 % Khoai tây 20g Agar 2 %
Đun khoai tây khoảng 15 phút để chiết dịch, hòa dịch cùng với các hóa chất đã khuấy tan đều.
Chuẩn bị dụng cụ đĩa petri, đầu cone sạch và dùng bịch kiếng để bịt kín.
Khử trùng môi trường và dụng cụ với 20 phút/1150C , để vào water bath sau khi khử trùng xong.
Phân phối môi trường vào đĩa petri (độ dày khoảng 2 mm). Sau đó đem trữ tủ mát.
Phụ lục 4. Phương pháp đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng dịch nấm men trên ở mật số 102, lắc đều, dùng ống hút 1 giọt vào mặt kính, đậy lá kính lên lưới đếm. Chú ý không để tạo bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh.
Đặt buồng kính lên bàn kính hiển vi, sau đó tiến hành đếm 4 ô lớn ở 4 góc. Trong mỗi ô lớn, đếm lần lượt từ ô con thứ nhất đến ô con thứ 16. Chỉ đếm những tế bào nằm trong ô con và nằm 2 cạnh liên tiếp cùng chiều.
Ghi số lượng tế bào, tính giá trị trung bình.
Sau khi dùng xong buồng đếm và lá kính phải được đem rửa ngay và lau khô. Số lượng tế bào trong 100 ml mẫu được tính theo công thức:
Số tế bào/ml 016 . 0 * 10 * 3 d a
Trong đó: a: trung bình số tế bào đếm được d: độ pha loãng
103: chuyển 1 mm3 thành 1 ml
(Nguyễn Xuân Thành et al, 2005)
Phụ lục 5. Phương pháp xác định hàm lượng đường sinh ra bằng phương pháp
chưng cất
Cho 100 ml dung dịch sau khi lên men vào bình cầu của hệ thống chưng cất, tiến hành chưng cất cồn và thu lấy 100 ml, chú ý là không để cho rượu bay hơi.
Sau khi để dịch cất ổn định nhiệt độ, cho dịch cất vào ống đong có đường kính to gấp 2 lần đường nơi to nhất của kính rượu kế. Thả rượu kế vào và đọc độ rượu (dùng rượu kế 0 – 300 và nhiệt độ sau đó được quy về nhiệt độ chuẩn 200C.
Phụ lục 6. Phương pháp xác định đặc điểm hình hình thái và sinh lý của nấm men 6.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men
Quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa, sau khi có các khuẩn lạc riêng biệt trên thạch đĩa thì ghi nhận các đặc : hình thái, kích thước, độ dày, có vòng tròn đồng tâm hay không, mặt khuẩn lạc nhẵn ướt, khô hay sần và màu sắc khuẩn lạc.
6.2. Đặc điểm sinh lý tế bào nấm men 6.2.1. Sự đồng hóa đường
Nấm men có khả năng đồng hóa nguồn đường cho sinh trưởng, tăng sinh khối và cho lên men chuyển đường thành rượu. Nấm men đồng hóa đường theo nguyên tắc sau:
Những loài nấm men không lên men đường glucose thì không lên men các loại đường khác.
Không có nấm men lên men đồng thời đường Maltose và Lactose.
Thông thường người ta chỉ lên men các loại đường Glucose, Saccharose, Maltose và Galactose. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6.2.2. Xác định khả năng hoạt hóa urea
Sử dụng môi trường Christensen urea broth (g/L: yeast extract 0,1; potassium di- hydrogen phosphate 9,1; di-potassium hydrogen phosphate 9,5; urea 20; phenol red 0,01; ph 6,8 ± 0,2). Sau đó khử trùng nhiệt ướt 1150C/20 phút, đợi môi trường nguội chủng nấm men và ủ 300C/ 7 ngày. Kết quả dương tính với thử nghiệm sẽ chuyển sang màu đỏ sẫm.
Phụ lục 7. Số liệu thí nghiệm 7.1. Số liệu thí nghiệm 2
Bảng 10. Độ brix, pH và độ cồn sau lên men 10 ngày
Lần lặp lại Tên dòng pH Brix Độ cồn
( 200C) Lần 1 2.1 4,25 10 12 Lần 2 2.1 4,11 11 10,5 Lần 3 2.1 4,14 9,7 13,2 Lần 1 HGC3 4,05 11 10,77 Lần 2 HGC3 4,8 10 13,28 Lần 3 HGC3 4 12,3 10,88 Lần 1 DGC1 4,05 11,2 12,3 Lần 2 DGC1 4,05 11 9,95 Lần 3 DGC1 4,1 11 13,02 Lần 1 DCL1 4,01 9,8 12,65 Lần 2 DCL1 4,04 11 12,06 Lần 3 DCL1 3,98 11,5 11,7 Lần 1 DCL2 4,05 10,2 12,48 Lần 2 DCL2 3,99 13 11,29
Lần 3 DCL2 4,01 13,9 9,94 Lần 1 DBT1 4 10,2 10,62 Lần 2 DBT1 4,05 11,2 9,61 Lần 3 DBT1 4,15 10,2 12,3