6. Xác định hoạt tính phân giải Urea
2.2.9. Những nhân tố ảnh hưởng hoạt tính nấm men
2.2.9.1.Nồng độ dịch đường
Nồng độ dịch đường quá cao dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý cảu nấm men. Kết quả là rượu nhiều sẽức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặc khác, đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men.
Nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men. Mặc khác sẽ tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải.
Bình thường chất khô của dịch đường được khống chế ở khoảng 16 – 18 % tùy theo mức độ thuần khiết, tương đương 13 – 15 % đường, để sau khi lên men sẽ nhận được độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % v/v (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.9.2.Nhiệt độ
Nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng của đa số nấm men là 28 – 32oC và nhiệt độ thích hợp để lên men rượu vang là 20 – 25oC. Nhiệt độ lên men cao khoảng 30 – 35oC thì sự bắt đầu tích tụ rượu ethylic xảy ra sớm, tốc độ lên men nhanh nhưng kết thúc sớm nên không lên men hết đường. Lượng đường sót này bị vi khuẩn lactic sử dụng để tạo acid lactic, làm ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm. Lên men ở nhiệt độ cao cũng tạo điều kiện cho vi sinh vật tạp nhiễm phát triển nhanh, làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm và sinh ra các sản phẩm phụ gây độc (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.9.3.pH môi trường
Mỗi chủng vi sinh vật có khoảng pH thích ứng hay tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển. Giống men sử dụng cho lên men rượu vang có thể lên men ở pH = 2,8 – 3,8. Việc nâng cao độ acid của môi trường làm cho nấm men thay đổi hình dáng: tế bào trở nên nhỏ hơn với dạng hình tròn nhiều hơn và trong tế bào chất tích tụ các chất béo (Lương Đức Phẩm, 2006).
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo rượu ethylic là 4,5 – 5,0 (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2007).
2.2.9.4.Oxi hòa tan – độ hiếu khí
Nấm men cần oxy để sinh sản và phát triển. Tuy nhiên, nếu sự có mặt của oxy trong môi trường quá lượng cho phép trong lên men sẽ kéo dài pha sinh trưởng, giảm
tốc độ lên men của tế bào nấm men và làm tăng hàm lượng đường sót. Vì vậy, hàm lượng oxy vượt quá mức cho phép sẽ ảnh hưởng xấu đến hương vị sản phẩm (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.9.5. Khí CO2
Dưới áp suất khí quyển, CO2 không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men và quá trình lên men. Nếu loại bỏ CO2 từ môi trường bằng nitơ hay không khí thì quá trình lên men không tăng nhanh hơn. Nếu CO2 tạo thành được rút ra bằng bơm chân không thì tốc độ lên men sẽ tăng nhanh hơn nhưng không nhiều. Khi khí quyển trên bề mặt lên men được thay bằng CO2 thì lực lên men của men bia tăng gấp 3 – 4 lần. Khi bơm CO2 vào môi trường với các chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh, kích thước tế bào nấm men tăng lên và ngược lại. Tóm lại, dưới áp suất dư của CO2, tế bào nấm men tăng lên đáng kể và có dạng hình tròn chiếm đa số. Ở nồng độ xác định, khí CO2 cũng kìm hãm sự sinh sản của nấm men (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.9.6.Rượu ethylic
Trong 1 – 2 giờ đầu gieo cấy vào môi trường lên men, nấm men chưa thích nghi nên chưa phát triển. Sau đó, nấm men sẽ phát triển theo cấp số nhân và tích tụ rượu ethylic.
Khi hàm lượng rượu cao sẽ khiến sự sinh trưởng của nấm men chậm dần. Khi nồng độ rượu cao quá sẽ làm giảm hoạt tính của nấm men, thậm chí làm ngưng hẳn sự phát triển của chúng.
Các loại rượu khác nhau có tác dụng ức chế nấm men khác nhau. Khả năng chịu được nồng độ rượu của các chủng nấm men khác nhau cũng không giống nhau. Nấm men có khả năng tạo nhiều rượu ethylic trong môi trường thì có khả năng chịu được độ rượu cao (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.10. Hệ vi sinh vật trong dịch trái và hạt ca cao 2.2.10.1.Nấm men
Nấm men Saccharomyces Cerevisiae là chủ yếu (ngoài ra người ta còn tìm thấy có 12 loài nấm men khác nữa có mặt trong khối lên men ca cao nhưng số lượng không nhiều) (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.2.10.2.Vi khuẩn
Vi khuẩn tạo ra mùi hôi cho rượu vang. Tuy nhiên, vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình lên men phụ tạo mùi thơm cho rượu vang.
Lactobacillus lactis Lactobacillus plantarum Acetobacter aceti Gluconobacter oxydans (Lương Đức Phẩm, 2006). 2.2.10.3.Nấm mốc
Bào tử nấm mốc Mucor, Penicillin và Aspergillus niger thường hiện diện trên vỏ quả. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng nảy mầm và phát triển trên bề mặt dịch lên men (Lương Đức Phẩm, 2006).
2.3. Quá trình lên men rượu vang 2.3.1. Khái quát 2.3.1. Khái quát
Quá trình lên men gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn lên men chính: Dùng dịch nước ép (và hạt ca cao) để lên men thành rượu. Sau đó chuyển sang giai đoạn ủ làm cho protein, peptin, tanin lắng xuống cho rượu trong hơn.
Giai đoạn lên men thứ cấp (giai đoạn ủ): từ 3 – 4 tháng. Trong giai đoạn ủ sẽ tích tụ CO2 và chất thơm.
Ủ thông thường: sẽ tạo rượu vang non sau đó có thểủ trong thùng gỗ sồi để tạo hương thơm đặc trưng.
Ủ chính trong thùng hay trong chai lượng C02 cao tạo sâmpanh. Rượu vang trong dùng để sản xuất rượu mạnh bằng phương pháp chưng cất.
2.3.2. Phản ứng thủy phân lớp thịt bao quanh hạt ca cao
(PE, PG)
Pectin (Galactose)n Glucose (Chu trình EMP)
Acid Pyruvic Rượu ethylic Glucose
(Lên men giấm)
2.3.3. Phản ứng sinh hóa xảy ra bên trong hạt ca cao
2.3.4. Cơ chế của quá trình lên men ca cao
Trong 24 giờ đầu: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 dưới sự hoạt động của nấm men trong điều kiện kỵ khí không bắt buộc. Ngoài ra còn có một số sản phẩm phụ khác như acid lactic, acid oxalic, enzyme ngoại bào, hợp chất hữu cơ dễ bay hơi.
Đến 24 giờ tiếp theo: thịt quả bị phân rã và chiết rút hết, tạo điều kiện thông thoáng cho khối ủ. Hơn nữa sau 2-3 ngày đầu lên men thường tiến hành đảo trộn khối hạt. Do có mặt của O2 nên cồn bị oxi hóa thành acid acetic dưới sự hoạt động của vi khuẩn acetic:
C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + Q
Cuối quá trình lên men, lượng cồn và acid lactic giảm dần, chỉ còn acid acetic. Nhờ acid acetic và nhiệt độ cao (sau 2 ngày lên men) làm cho màng tế bào bị vỡ và các chất dễ hòa trộn vào nhau. Điều này cho phép một số chất phức tạp chuyển sang trạng thái hoạt động (hoạt động của enzyme, quá trình oxi hóa, quá trình phân giải protein thành amino acid) Sự hoạt động của những chất này là yếu tố quyết định đến màu và mùi của bột ca cao sau này. Tuy nhiên sự có mặt của acid acetic trong hạt ca cao sẽ làm tăng độ chua của sản phẩm cuối sau này. Do đó sau quá trình lên men bắt buộc phải có giai đoạn làm khô hạt ca cao để acid acetic bị oxi hóa.
2.4. Một số nguyên cứu về đề tài phân lập, tuyển chọn và ứng dụng nấm men tự
lên men rượu vang
Theo Nguyễn Thị Phượng Kiều (2011), trong điều kiện ban đầu 26oBrix, pH 3,7 với dòng nấm men phân lập từ dịch ca cao lên men tự nhiên có mật số 105 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (16% v/v) sau khi lên men 8 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt này được xác định là Saccharomyces cerevisiae. Protease Peptidase Amino Acid Protein Peptid (Invertase) (enzyme PPO)
Polyphenol Sắc tố màu nâu Glucose + Fructose Saccharose
Theo nghiên cứu của Ngô Thị Phương Dung và ctv. (2011), phân lập nấm men từ 4 nguồn dưa hấu trên môi trường Sabouraud được 6 dòng nấm men thuần so sánh khả năng lên men với nấm men thương mại đã chọn ra được dòng nấm men
Saccharomyces cerevisiae thương mại do Thái Lan sản xuất cho hiệu quả lên men cao và giá trị cảm quan tốt. Quy trình lên men rượu vang dưa hấu đạt hiệu quả, chất lượng tốt và đạt tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) khi lên men với các thông số: mật số nấm men là 107 tế bào/ml, độ Brix 30 và thời gian lên men 10 ngày ở 25oC.
Theo Nguyễn Văn Thành và ctv. (2013). Phân lập, tuyển chọn, phân lập và định danh nấm men trong lên men rượu vang khóm. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học. Trường Đại học Cần Thơ, 27 – 35. Phân lập được 23 dòng nấm men từ khóm (giống Queen) thu hoạch ở 3 địa điểm: Vị Thanh (tỉnh Hậu Giang), Long Mỹ (tỉnh Hậu Giang) và Gò Quao (Kiên Giang) với 2 dạng lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường. Nước khóm tươi được điều chỉnh pH 4,5, tổng chất khô hòa tan 200 Brix, mật số nấm men 106 tế bào/ml và thời gian lên men 10 ngày ở 28 – 300C. Dựa trên mô tả các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý bước đầu đã xác định được 3 giống nấm men
Saccharomyces, Hanseniaspora và Pichia. Dòng nấm men VK1 phân lập từ dịch khóm (trái thu hoạch tại Vị Thanh) lên men tự nhiên (được tuyển chọn từ 23 dòng nấm men phân lập) là dòng nấm men có hoạt lực lên men cao nhất (độ cồn đạt được 13,26% v/v). Thực hiện định danh bằng phương pháp giải trình tự đã xác định dòng VK1 là loài Saccharomyces cerevisiae.
Theo Nguyễn Thị Hiền (2011), trong điều kiện ban đầu 26oBrix, pH 3,5 với dòng nấm men phân lập từ dịch trái nhãn lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường có mật số 105 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (13% v/v) sau khi lên men 12 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt tạo ra rượu nhãn tốt nhất là nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Theo Nguyễn Phúc Trường (2011), trong điều kiện ban đầu 23oBrix, pH 4 với dòng nấm men phân lập từ dịch cam lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường có mật số 107 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (13% v/v) sau khi lên men 8 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt tạo ra rượu cam tốt nhất là nấm men Zygosaccharosemyces cidri.
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014.
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1. Thiết bị
Tủ cấy vô trùng, máy ủ lắc, kính hiển vi chụp hình Olympus CX31 và camera ToupCam 3.1 MP, nồi thanh trùng nhiệt ướt 19L, tủ lạnh, cân phân tích điện tử, máy chuẩn độ pH tự động, chiết quang kế, thiết bị chưng cất cồn và một số thiết bị khác trong phòng thí nghiệm.
3.1.2.2. Dụng cụ
Đĩa petri, ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác 250ml, 500ml, ống Durham, nhiệt kế, que cấy trang, que cấy gạt, micropipet (2 – 1000 μl), buồng đếm hồng cầu, cồn kế 0 – 30o và một số dụng cụ khác.
3.1.3. Hóa chất
Bảng 6. Hóa chất
Môi trường tăng Môi trường PGA
Khoai tây 20 g D-glucose 2 % D-glucose 2 % Khoai tây 20 g
Agar 2 %
3.1.5. Phương pháp thí nghiệm
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao lên men
3.2.1.1. Mục đích
Tách riêng các dòng nấm men từ quần thể vi sinh vật tồn tại tự nhiên từ dịch và hạt trái ca cao từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
3.2.1.2. Bố trí thí nghiệm
Địa điểm thu mẫu là các huyện Chợ Lách, Giồng Chôm và Thành Phố (Tỉnh Bến Tre)
3.2.1.3. Phương pháp thực hiện
Dịch ca cao thu mua về kiểm tra độ Brix ban đầu. Sau đó, rót 100 ml dịch ca cao vào bình tam giác 250 ml và để lên men ở điều kiện tự nhiên trong 48 giờ.
Sử dụng micropipet hút 10 μl dịch lên men (đã pha loãng ở nồng độ 10-4) nhỏ lên bề mặt của môi trường phân lập. Sử dụng que gạt để phân bố đều lượng mẫu trên bề mặt môi trường và ủở nhiệt độ 30oC.
Hình 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hạt ca cao Nuôi trong môi trường
tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ)
Khảo sát hoạt tính và tuyển chọn nấm men có hoạt tính cao nhất
Nấm men thuần chủng Trữ giống
Nhân giống
Lên men rượu vang ca cao Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri Tách ròng
Sau 2 ngày ủ mẫu, chọn khuẩn lạc sau khi trải tiến hành cấy phân lập nhiều lần trên môi trường dinh dưỡng để đạt độ thuần chủng mong muốn.
Nếu khuẩn lạc đã đồng nhất, tiến hành cấy truyền sang ống thạch nghiêng để giữ giống. Sơ đồ bố trí ở (Hình 3.2)
3.2.1.4. Chỉ tiêu theo dõi
- Các chủng nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước tế bào nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước bề mặt và mép của khuẩn lạc nấm men. - Hình chụp các khuẩn lạc và tế bào nấm men.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao
3.2.2.1. Mục đích
Từ kết quả các dòng nấm men phân lập được và một số dòng nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Tiến hành Thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao, phù hợp cho quá trình sản xuất rượu vang ca cao (hoạt lực lên men mạnh và độ cồn cao).
3.2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố. Nhân tố là các dòng nấm men, bao gồm 9 dòng nấm men phân lập thuần chủng được lựa chọn từ thí
Hình 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao
Hạt ca cao
Nuôi trong môi trường tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ)
Nuôi cấy Nấm men thuần chủng
Trữ giống (40C) Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri
Tách ròng Đo Brix
Số nghiệm thức: 10; tổng số đơn vị thí nghiệm: 10 x 3 = 30
3.2.2.3.Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra bằng phương pháp ống Durham để xác định cường độ lên men của nấm men và cho lên men.
* Xác định cường độ lên men bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra.
Chuẩn bị dịch nấm men:
+ Nuôi nấm men thuần vừa được phân lập ở thí nghiệm 1 trong môi trường nuôi cấy (không có agar) ở 30oC trong 24 giờ.
+ Nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học: hồi sinh nấm men khô trong nước cất, ủ trong 30 phút.
Tiến hành đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (phụ lục).
Chuẩn bị dịch ca cao: Dịch ca cao được lọc và điều chỉnh đến pH 4,0 và 24oBrix. Thanh trùng dịch ca cao này bằng NaHSO3 (140 mg/l) trong 2 giờ.
Trong điều kiện vô trùng, cho 9 ml dịch ca cao vào mỗi chai Durham. Khảo sát hoạt tính nấm men: nấm men được bổ sung vào 1ml dung dịch trên với mật độ 105 tế bào/ml. Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (30±2oC). Phân tích mẫu sau thời gian kết thúc lên men chính.
* Lên men
Dịch ca cao được chỉnh độ 24oBrix bằng Brix kế (bổ sung đường) và pH = 4.0 bằng pH kế (bổ sung acid citric).
Cho 100 ml dịch ca cao vào mỗi bình tam giác. Sau đó thanh trùng bằng NaHSO3 140 mg/l trong 2 giờ nhằm để loại những men tạp nhiễm và vi sinh vật lạ. Tiếp theo bổ sung nấm men theo bố trí thí nghiệm nêu trên (cùng mật số 106 tế bào/ ml dịch ca cao). Khuấy trộn và đậy kín các bình lên men. Để quá trình lên men ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát và tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong khoảng thời gian 10 ngày (Hình 7).
3.2.2.4. Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cột khí CO2 (mm) theo thời gian, 1,2,3,4,5…40 giờ lên men.
- Độ Brix của dịch ca cao sau lên men. - pH của dịch ca cao sau lên men.
- Độ cồn tạo thành (%) (phương pháp chưng cất).
Từ kết quả thu được qua các chỉ tiêu khảo sát, dòng nấm men có hoạt tính lên men tốt, cho độ cồn cao được chọn lựa.