6. Xác định hoạt tính phân giải Urea
2.3.4. Cơ chế của quá trình lên men ca cao
Trong 24 giờ đầu: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 dưới sự hoạt động của nấm men trong điều kiện kỵ khí không bắt buộc. Ngoài ra còn có một số sản phẩm phụ khác như acid lactic, acid oxalic, enzyme ngoại bào, hợp chất hữu cơ dễ bay hơi.
Đến 24 giờ tiếp theo: thịt quả bị phân rã và chiết rút hết, tạo điều kiện thông thoáng cho khối ủ. Hơn nữa sau 2-3 ngày đầu lên men thường tiến hành đảo trộn khối hạt. Do có mặt của O2 nên cồn bị oxi hóa thành acid acetic dưới sự hoạt động của vi khuẩn acetic:
C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + Q
Cuối quá trình lên men, lượng cồn và acid lactic giảm dần, chỉ còn acid acetic. Nhờ acid acetic và nhiệt độ cao (sau 2 ngày lên men) làm cho màng tế bào bị vỡ và các chất dễ hòa trộn vào nhau. Điều này cho phép một số chất phức tạp chuyển sang trạng thái hoạt động (hoạt động của enzyme, quá trình oxi hóa, quá trình phân giải protein thành amino acid) Sự hoạt động của những chất này là yếu tố quyết định đến màu và mùi của bột ca cao sau này. Tuy nhiên sự có mặt của acid acetic trong hạt ca cao sẽ làm tăng độ chua của sản phẩm cuối sau này. Do đó sau quá trình lên men bắt buộc phải có giai đoạn làm khô hạt ca cao để acid acetic bị oxi hóa.
2.4. Một số nguyên cứu về đề tài phân lập, tuyển chọn và ứng dụng nấm men tự
lên men rượu vang
Theo Nguyễn Thị Phượng Kiều (2011), trong điều kiện ban đầu 26oBrix, pH 3,7 với dòng nấm men phân lập từ dịch ca cao lên men tự nhiên có mật số 105 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (16% v/v) sau khi lên men 8 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt này được xác định là Saccharomyces cerevisiae. Protease Peptidase Amino Acid Protein Peptid (Invertase) (enzyme PPO)
Polyphenol Sắc tố màu nâu Glucose + Fructose Saccharose
Theo nghiên cứu của Ngô Thị Phương Dung và ctv. (2011), phân lập nấm men từ 4 nguồn dưa hấu trên môi trường Sabouraud được 6 dòng nấm men thuần so sánh khả năng lên men với nấm men thương mại đã chọn ra được dòng nấm men
Saccharomyces cerevisiae thương mại do Thái Lan sản xuất cho hiệu quả lên men cao và giá trị cảm quan tốt. Quy trình lên men rượu vang dưa hấu đạt hiệu quả, chất lượng tốt và đạt tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) khi lên men với các thông số: mật số nấm men là 107 tế bào/ml, độ Brix 30 và thời gian lên men 10 ngày ở 25oC.
Theo Nguyễn Văn Thành và ctv. (2013). Phân lập, tuyển chọn, phân lập và định danh nấm men trong lên men rượu vang khóm. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học. Trường Đại học Cần Thơ, 27 – 35. Phân lập được 23 dòng nấm men từ khóm (giống Queen) thu hoạch ở 3 địa điểm: Vị Thanh (tỉnh Hậu Giang), Long Mỹ (tỉnh Hậu Giang) và Gò Quao (Kiên Giang) với 2 dạng lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường. Nước khóm tươi được điều chỉnh pH 4,5, tổng chất khô hòa tan 200 Brix, mật số nấm men 106 tế bào/ml và thời gian lên men 10 ngày ở 28 – 300C. Dựa trên mô tả các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý bước đầu đã xác định được 3 giống nấm men
Saccharomyces, Hanseniaspora và Pichia. Dòng nấm men VK1 phân lập từ dịch khóm (trái thu hoạch tại Vị Thanh) lên men tự nhiên (được tuyển chọn từ 23 dòng nấm men phân lập) là dòng nấm men có hoạt lực lên men cao nhất (độ cồn đạt được 13,26% v/v). Thực hiện định danh bằng phương pháp giải trình tự đã xác định dòng VK1 là loài Saccharomyces cerevisiae.
Theo Nguyễn Thị Hiền (2011), trong điều kiện ban đầu 26oBrix, pH 3,5 với dòng nấm men phân lập từ dịch trái nhãn lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường có mật số 105 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (13% v/v) sau khi lên men 12 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt tạo ra rượu nhãn tốt nhất là nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Theo Nguyễn Phúc Trường (2011), trong điều kiện ban đầu 23oBrix, pH 4 với dòng nấm men phân lập từ dịch cam lên men tự nhiên và lên men có bổ sung đường có mật số 107 tế bào/ml cho độ cồn cao nhất (13% v/v) sau khi lên men 8 ngày ở 30oC. Kết quả định danh bằng kỹ thuật Biolog, dòng nấm men ưu việt tạo ra rượu cam tốt nhất là nấm men Zygosaccharosemyces cidri.
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014.
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1. Thiết bị
Tủ cấy vô trùng, máy ủ lắc, kính hiển vi chụp hình Olympus CX31 và camera ToupCam 3.1 MP, nồi thanh trùng nhiệt ướt 19L, tủ lạnh, cân phân tích điện tử, máy chuẩn độ pH tự động, chiết quang kế, thiết bị chưng cất cồn và một số thiết bị khác trong phòng thí nghiệm.
3.1.2.2. Dụng cụ
Đĩa petri, ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác 250ml, 500ml, ống Durham, nhiệt kế, que cấy trang, que cấy gạt, micropipet (2 – 1000 μl), buồng đếm hồng cầu, cồn kế 0 – 30o và một số dụng cụ khác.
3.1.3. Hóa chất
Bảng 6. Hóa chất
Môi trường tăng Môi trường PGA
Khoai tây 20 g D-glucose 2 % D-glucose 2 % Khoai tây 20 g
Agar 2 %
3.1.5. Phương pháp thí nghiệm
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao lên men
3.2.1.1. Mục đích
Tách riêng các dòng nấm men từ quần thể vi sinh vật tồn tại tự nhiên từ dịch và hạt trái ca cao từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
3.2.1.2. Bố trí thí nghiệm
Địa điểm thu mẫu là các huyện Chợ Lách, Giồng Chôm và Thành Phố (Tỉnh Bến Tre)
3.2.1.3. Phương pháp thực hiện
Dịch ca cao thu mua về kiểm tra độ Brix ban đầu. Sau đó, rót 100 ml dịch ca cao vào bình tam giác 250 ml và để lên men ở điều kiện tự nhiên trong 48 giờ.
Sử dụng micropipet hút 10 μl dịch lên men (đã pha loãng ở nồng độ 10-4) nhỏ lên bề mặt của môi trường phân lập. Sử dụng que gạt để phân bố đều lượng mẫu trên bề mặt môi trường và ủở nhiệt độ 30oC.
Hình 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hạt ca cao Nuôi trong môi trường
tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ)
Khảo sát hoạt tính và tuyển chọn nấm men có hoạt tính cao nhất
Nấm men thuần chủng Trữ giống
Nhân giống
Lên men rượu vang ca cao Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri Tách ròng
Sau 2 ngày ủ mẫu, chọn khuẩn lạc sau khi trải tiến hành cấy phân lập nhiều lần trên môi trường dinh dưỡng để đạt độ thuần chủng mong muốn.
Nếu khuẩn lạc đã đồng nhất, tiến hành cấy truyền sang ống thạch nghiêng để giữ giống. Sơ đồ bố trí ở (Hình 3.2)
3.2.1.4. Chỉ tiêu theo dõi
- Các chủng nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước tế bào nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước bề mặt và mép của khuẩn lạc nấm men. - Hình chụp các khuẩn lạc và tế bào nấm men.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao
3.2.2.1. Mục đích
Từ kết quả các dòng nấm men phân lập được và một số dòng nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Tiến hành Thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao, phù hợp cho quá trình sản xuất rượu vang ca cao (hoạt lực lên men mạnh và độ cồn cao).
3.2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố. Nhân tố là các dòng nấm men, bao gồm 9 dòng nấm men phân lập thuần chủng được lựa chọn từ thí
Hình 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao
Hạt ca cao
Nuôi trong môi trường tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ)
Nuôi cấy Nấm men thuần chủng
Trữ giống (40C) Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri
Tách ròng Đo Brix
Số nghiệm thức: 10; tổng số đơn vị thí nghiệm: 10 x 3 = 30
3.2.2.3.Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra bằng phương pháp ống Durham để xác định cường độ lên men của nấm men và cho lên men.
* Xác định cường độ lên men bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra.
Chuẩn bị dịch nấm men:
+ Nuôi nấm men thuần vừa được phân lập ở thí nghiệm 1 trong môi trường nuôi cấy (không có agar) ở 30oC trong 24 giờ.
+ Nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học: hồi sinh nấm men khô trong nước cất, ủ trong 30 phút.
Tiến hành đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (phụ lục).
Chuẩn bị dịch ca cao: Dịch ca cao được lọc và điều chỉnh đến pH 4,0 và 24oBrix. Thanh trùng dịch ca cao này bằng NaHSO3 (140 mg/l) trong 2 giờ.
Trong điều kiện vô trùng, cho 9 ml dịch ca cao vào mỗi chai Durham. Khảo sát hoạt tính nấm men: nấm men được bổ sung vào 1ml dung dịch trên với mật độ 105 tế bào/ml. Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (30±2oC). Phân tích mẫu sau thời gian kết thúc lên men chính.
* Lên men
Dịch ca cao được chỉnh độ 24oBrix bằng Brix kế (bổ sung đường) và pH = 4.0 bằng pH kế (bổ sung acid citric).
Cho 100 ml dịch ca cao vào mỗi bình tam giác. Sau đó thanh trùng bằng NaHSO3 140 mg/l trong 2 giờ nhằm để loại những men tạp nhiễm và vi sinh vật lạ. Tiếp theo bổ sung nấm men theo bố trí thí nghiệm nêu trên (cùng mật số 106 tế bào/ ml dịch ca cao). Khuấy trộn và đậy kín các bình lên men. Để quá trình lên men ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát và tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong khoảng thời gian 10 ngày (Hình 7).
3.2.2.4. Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cột khí CO2 (mm) theo thời gian, 1,2,3,4,5…40 giờ lên men.
- Độ Brix của dịch ca cao sau lên men. - pH của dịch ca cao sau lên men.
- Độ cồn tạo thành (%) (phương pháp chưng cất).
Từ kết quả thu được qua các chỉ tiêu khảo sát, dòng nấm men có hoạt tính lên men tốt, cho độ cồn cao được chọn lựa.
Hình 7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao
Nấm men được tăng sinh (môi trường lỏng không có agar) và để trên máy lắc ở 300C/ 1 ngày
(10 dòng)
Đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng đến mật số 105
Chủng vào bình tam giác với mật số 103
Chủng vào ống Durham với mật số 104 Dịch ca cao được chỉnh 24 độ Brix, pH = 4 và
thanh trùng bằng NaHSO3/ 2 giờ
Thực hiện trong tủ cấy Thực hiện trong tủ cấy
Bình tam giác được gắn water clock và để lên men ở 300C/ 7 – 10 ngày
Theo dõi và đo chiều cao cột khí 1 – 2h /lần/24 giờ
3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH, độ Brix và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao của nấm men phân lập
3.2.3.1. Mục đích
Thiết lập các thông số lên men phù hợp cho quá trình sản xuất rượu vang ca cao từ nấm men phân lập thuần chủng có hoạt tính lên men cao.
3.2.3.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp thừa số với 3 nhân tố, 3 mức độ, 2 lần lặp lại.
Nhân tố C: pH của dịch lên men
C1: pH = 3.5 C2: pH = 4.0 C3: pH = 4.5 Nhân tố D: độ Brix của dịch lên men
D1: 24 D2: 26 D3: 28 Nhân tố E: mật số nấm men (tế bào/ml)
E1: 103 E2: 105 E3: 107 Tổng số nghiệm thức: 3 x 3 x 3 = 27 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần.
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 27 x 2 = 54 đơn vị thí nghiệm
3.2.3.3. Phương pháp thực hiện
Cách chuẩn bị dịch ca cao tương tự như thí nghiệm 2. Tuy nhiên, ở thí nghiệm này, dịch ca cao được điều chỉnh về các giá trị pH và độ Brix khảo sát. Kế tiếp, dịch này được thanh trùng với NaHSO3 140 mg/l trong 2 giờ. Sau đó, nấm men được bổ sung vào dịch ca cao sau khi thanh trùng với những mật số nêu trên và lên men 10 ngày ở nhiệt độ phòng 30 ± 2oC. (Mẫu được phân tích sau thời gian lên men chính)
3.2.3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
- Độ cồn tạo thành (%) (phụ lục)
- Độ Brix của dịch ca cao sau lên men. - pH của dịch ca cao sau lên men. Pha 103,105, 107 Dịch ca cao (5,4 lít) Chỉnh Brix 26 (1,8 lít) 28 (1,8 lít) 24 (1,8 lít) pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Hình 8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH, độ Brix và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao của nấm men phân lập
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ hạt và dịch trái ca cao lên men 4.1.1. Kết quả phân lập nấm men
Sau nhiều lần phân lập đã tìm được 18 dòng nấm men ở 3 địa điểm (Chợ Lách – Bến Tre, Giồng Trôm – Bến Tre và Thành Phố tỉnh Bến Tre).
4.1.1.1.Địa điểm thu mẫu ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Điều kiện xử lý: dịch trái ca cao lên men tự nhiên
Hình dạng nấm men phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 9).
Hình 9. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) oval nhỏ (DCL1), (b) cầu nhỏ (DCL2)
Kết quả phân lập cho thấy từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre) đã phân lập được 2 dòng nấm men là: hình oval nhỏ và hình cầu nhỏ khác nhau.
Nấm men hình oval nhỏ có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 1 mm.
Nấm men hình cầu nhỏ có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 1,5 mm.
* Điều kiện xử lý: hạt ca cao được nuôi tăng sinh
Hình dạng nấm men phân lập từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 10).
Hình 10. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt trái ca cao
được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) hình dài (HCL1), (b) elip ngắn (HCL2), (c) elip dài (HCL3), (d) hình oval lớn (HCL4)
(c) (d)
(b) (a)
Kết quả phân lập cho thấy từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre) đã phân lập được 4 dòng nấm men là: hình dài, elip ngắn, elip dài và oval lớn khác nhau.
Nấm men hình dài có khuẩn lạc gần tròn, màu trắng đục, bề mặt khô sần, mô nổi, rìa răng cưa nhỏ, kích thước 3.5 mm.
Nấm men hình elip ngắn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng đục, bề mặt khô và sần, rìa nguyên, kích thước 4 mm.
Nấm men hình elip dài có dạng khuẩn lạc giống HCL2, kích thước 3.5 mm. Nấm men hình oval lớn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.
4.1.1.2. Địa điểm thu mẫu ở Giồng Trôm (Bến Tre)
* Điều kiện xử lý: dịch trái ca cao lên men tự nhiên
Hình dạng nấm men phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 11).
Hình 11. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) cầu lớn (DGT1), (b) oval (DGT2), (c) elip dài (DGT3)
Kết quả phân lập cho thấy từ dịch ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre) đã phân lập được 3 dòng nấm men là: cầu lớn, oval và elip dài khác nhau.
Nấm men hình cầu lớn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 3 mm.
Nấm men hình oval có khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.