6. Xác định hoạt tính phân giải Urea
3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao lên men tự
3.2.1.1. Mục đích
Tách riêng các dòng nấm men từ quần thể vi sinh vật tồn tại tự nhiên từ dịch và hạt trái ca cao từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
3.2.1.2. Bố trí thí nghiệm
Địa điểm thu mẫu là các huyện Chợ Lách, Giồng Chôm và Thành Phố (Tỉnh Bến Tre)
3.2.1.3. Phương pháp thực hiện
Dịch ca cao thu mua về kiểm tra độ Brix ban đầu. Sau đó, rót 100 ml dịch ca cao vào bình tam giác 250 ml và để lên men ở điều kiện tự nhiên trong 48 giờ.
Sử dụng micropipet hút 10 μl dịch lên men (đã pha loãng ở nồng độ 10-4) nhỏ lên bề mặt của môi trường phân lập. Sử dụng que gạt để phân bố đều lượng mẫu trên bề mặt môi trường và ủở nhiệt độ 30oC.
Hình 5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hạt ca cao Nuôi trong môi trường
tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ)
Khảo sát hoạt tính và tuyển chọn nấm men có hoạt tính cao nhất
Nấm men thuần chủng Trữ giống
Nhân giống
Lên men rượu vang ca cao Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri Tách ròng
Sau 2 ngày ủ mẫu, chọn khuẩn lạc sau khi trải tiến hành cấy phân lập nhiều lần trên môi trường dinh dưỡng để đạt độ thuần chủng mong muốn.
Nếu khuẩn lạc đã đồng nhất, tiến hành cấy truyền sang ống thạch nghiêng để giữ giống. Sơ đồ bố trí ở (Hình 3.2)
3.2.1.4. Chỉ tiêu theo dõi
- Các chủng nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước tế bào nấm men.
- Hình dạng, màu sắc, kích thước bề mặt và mép của khuẩn lạc nấm men. - Hình chụp các khuẩn lạc và tế bào nấm men.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao
3.2.2.1. Mục đích
Từ kết quả các dòng nấm men phân lập được và một số dòng nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học. Tiến hành Thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao, phù hợp cho quá trình sản xuất rượu vang ca cao (hoạt lực lên men mạnh và độ cồn cao).
3.2.2.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố. Nhân tố là các dòng nấm men, bao gồm 9 dòng nấm men phân lập thuần chủng được lựa chọn từ thí
Hình 6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập nấm men từ dịch ca cao và hạt ca cao
Hạt ca cao
Nuôi trong môi trường tăng sinh Dịch ca cao
Lên men (30±2oC, 48 giờ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuôi cấy Nấm men thuần chủng
Trữ giống (40C) Cho vào môi trường phân lập
để tạo khuẩn lạc trên đĩa petri
Tách ròng Đo Brix
Số nghiệm thức: 10; tổng số đơn vị thí nghiệm: 10 x 3 = 30
3.2.2.3.Phương pháp thực hiện
Thí nghiệm được tiến hành bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra bằng phương pháp ống Durham để xác định cường độ lên men của nấm men và cho lên men.
* Xác định cường độ lên men bằng cách đo lượng khí CO2 sinh ra.
Chuẩn bị dịch nấm men:
+ Nuôi nấm men thuần vừa được phân lập ở thí nghiệm 1 trong môi trường nuôi cấy (không có agar) ở 30oC trong 24 giờ.
+ Nấm men tồn trữ có tại Viện NC&PT Công nghệ Sinh học: hồi sinh nấm men khô trong nước cất, ủ trong 30 phút.
Tiến hành đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu (phụ lục).
Chuẩn bị dịch ca cao: Dịch ca cao được lọc và điều chỉnh đến pH 4,0 và 24oBrix. Thanh trùng dịch ca cao này bằng NaHSO3 (140 mg/l) trong 2 giờ.
Trong điều kiện vô trùng, cho 9 ml dịch ca cao vào mỗi chai Durham. Khảo sát hoạt tính nấm men: nấm men được bổ sung vào 1ml dung dịch trên với mật độ 105 tế bào/ml. Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (30±2oC). Phân tích mẫu sau thời gian kết thúc lên men chính.
* Lên men
Dịch ca cao được chỉnh độ 24oBrix bằng Brix kế (bổ sung đường) và pH = 4.0 bằng pH kế (bổ sung acid citric).
Cho 100 ml dịch ca cao vào mỗi bình tam giác. Sau đó thanh trùng bằng NaHSO3 140 mg/l trong 2 giờ nhằm để loại những men tạp nhiễm và vi sinh vật lạ. Tiếp theo bổ sung nấm men theo bố trí thí nghiệm nêu trên (cùng mật số 106 tế bào/ ml dịch ca cao). Khuấy trộn và đậy kín các bình lên men. Để quá trình lên men ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát và tiến hành theo dõi các chỉ tiêu trong khoảng thời gian 10 ngày (Hình 7).
3.2.2.4. Chỉ tiêu theo dõi: chiều cao cột khí CO2 (mm) theo thời gian, 1,2,3,4,5…40 giờ lên men.
- Độ Brix của dịch ca cao sau lên men. - pH của dịch ca cao sau lên men.
- Độ cồn tạo thành (%) (phương pháp chưng cất).
Từ kết quả thu được qua các chỉ tiêu khảo sát, dòng nấm men có hoạt tính lên men tốt, cho độ cồn cao được chọn lựa.
Hình 7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men cao
Nấm men được tăng sinh (môi trường lỏng không có agar) và để trên máy lắc ở 300C/ 1 ngày
(10 dòng)
Đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng đến mật số 105
Chủng vào bình tam giác với mật số 103
Chủng vào ống Durham với mật số 104 Dịch ca cao được chỉnh 24 độ Brix, pH = 4 và
thanh trùng bằng NaHSO3/ 2 giờ
Thực hiện trong tủ cấy Thực hiện trong tủ cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bình tam giác được gắn water clock và để lên men ở 300C/ 7 – 10 ngày
Theo dõi và đo chiều cao cột khí 1 – 2h /lần/24 giờ
3.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH, độ Brix và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao của nấm men phân lập
3.2.3.1. Mục đích
Thiết lập các thông số lên men phù hợp cho quá trình sản xuất rượu vang ca cao từ nấm men phân lập thuần chủng có hoạt tính lên men cao.
3.2.3.2. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp thừa số với 3 nhân tố, 3 mức độ, 2 lần lặp lại.
Nhân tố C: pH của dịch lên men
C1: pH = 3.5 C2: pH = 4.0 C3: pH = 4.5 Nhân tố D: độ Brix của dịch lên men
D1: 24 D2: 26 D3: 28 Nhân tố E: mật số nấm men (tế bào/ml)
E1: 103 E2: 105 E3: 107 Tổng số nghiệm thức: 3 x 3 x 3 = 27 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần.
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 27 x 2 = 54 đơn vị thí nghiệm
3.2.3.3. Phương pháp thực hiện
Cách chuẩn bị dịch ca cao tương tự như thí nghiệm 2. Tuy nhiên, ở thí nghiệm này, dịch ca cao được điều chỉnh về các giá trị pH và độ Brix khảo sát. Kế tiếp, dịch này được thanh trùng với NaHSO3 140 mg/l trong 2 giờ. Sau đó, nấm men được bổ sung vào dịch ca cao sau khi thanh trùng với những mật số nêu trên và lên men 10 ngày ở nhiệt độ phòng 30 ± 2oC. (Mẫu được phân tích sau thời gian lên men chính)
3.2.3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
- Độ cồn tạo thành (%) (phụ lục)
- Độ Brix của dịch ca cao sau lên men. - pH của dịch ca cao sau lên men. Pha 103,105, 107 Dịch ca cao (5,4 lít) Chỉnh Brix 26 (1,8 lít) 28 (1,8 lít) 24 (1,8 lít) pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 pH= 3,5 pH= 4 pH= 4,5 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Pha 103,105, 107 Pha 103,105, 107
Hình 8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của pH, độ Brix và mật số nấm men đến khả năng lên men rượu vang ca cao của nấm men phân lập
CHƯƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ hạt và dịch trái ca cao lên men 4.1.1. Kết quả phân lập nấm men
Sau nhiều lần phân lập đã tìm được 18 dòng nấm men ở 3 địa điểm (Chợ Lách – Bến Tre, Giồng Trôm – Bến Tre và Thành Phố tỉnh Bến Tre).
4.1.1.1.Địa điểm thu mẫu ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Điều kiện xử lý: dịch trái ca cao lên men tự nhiên
Hình dạng nấm men phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 9).
Hình 9. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) oval nhỏ (DCL1), (b) cầu nhỏ (DCL2) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả phân lập cho thấy từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Chợ Lách (Bến Tre) đã phân lập được 2 dòng nấm men là: hình oval nhỏ và hình cầu nhỏ khác nhau.
Nấm men hình oval nhỏ có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 1 mm.
Nấm men hình cầu nhỏ có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 1,5 mm.
* Điều kiện xử lý: hạt ca cao được nuôi tăng sinh
Hình dạng nấm men phân lập từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 10).
Hình 10. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt trái ca cao
được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) hình dài (HCL1), (b) elip ngắn (HCL2), (c) elip dài (HCL3), (d) hình oval lớn (HCL4)
(c) (d)
(b) (a)
Kết quả phân lập cho thấy từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Chợ Lách (Bến Tre) đã phân lập được 4 dòng nấm men là: hình dài, elip ngắn, elip dài và oval lớn khác nhau.
Nấm men hình dài có khuẩn lạc gần tròn, màu trắng đục, bề mặt khô sần, mô nổi, rìa răng cưa nhỏ, kích thước 3.5 mm.
Nấm men hình elip ngắn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng đục, bề mặt khô và sần, rìa nguyên, kích thước 4 mm.
Nấm men hình elip dài có dạng khuẩn lạc giống HCL2, kích thước 3.5 mm. Nấm men hình oval lớn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.
4.1.1.2. Địa điểm thu mẫu ở Giồng Trôm (Bến Tre)
* Điều kiện xử lý: dịch trái ca cao lên men tự nhiên
Hình dạng nấm men phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 11).
Hình 11. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) cầu lớn (DGT1), (b) oval (DGT2), (c) elip dài (DGT3)
Kết quả phân lập cho thấy từ dịch ca cao lên men tự nhiên ở Giồng Trôm (Bến Tre) đã phân lập được 3 dòng nấm men là: cầu lớn, oval và elip dài khác nhau.
Nấm men hình cầu lớn có khuẩn lạc tròn, mô nổi, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 3 mm.
Nấm men hình oval có khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.
Nấm men hình elip dài có khuẩn lạc tròn, màu trắng ngà, mô lài, viền ngoài màu trắng đục, bề mặt khô sần, rìa răng cưa nhỏ, kích thước 7 mm.
* Điều kiện xử lý: hạt ca cao được nuôi tăng sinh
Hình dạng nấm men phân lập từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Giồng Trôm (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 12).
(c) (b)
Hình 12. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từhạt ca cao được
nuôi tăng sinhở Giồng Chôm (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) oval nhỏ (HGT1), (b) elip ngắn (HGT2), (c) cầu (HGT3), (d) elip dài (HGT4), (e) cầu nhỏ (HGT5)
Kết quả phân lập cho thấy từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Giồng Trôm (Bến (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tre) đã phân lập được 5 dòng nấm men là: oval nhỏ, elip ngắn, cầu, elip dài và cầu nhỏ khác nhau.
Nấm men hình oval nhỏ có khuẩn lạc tròn, mô nổi , màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 1,8 mm.
Nấm men hình elip ngắn có khuẩn lạc to, khô, mô lài, màu trắng ngà, viền ngoài màu trắng đục, rìa răng cưa nhỏ, kích thước 6 mm.
Nấm men hình cầu có khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 5 mm.
Nấm men hình elip dài có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mô nổi, bề mặt khô sần, rìa nguyên, kích thước 3 mm.
Nấm men hình cầu nhỏ có khuẩn lạc tròn, trắng sữa , mô lài, có viền gần trung tâm, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 5 mm.
4.1.1.3. Địa điểm thu mẫu ở Thành phố (Bến Tre)
* Điều kiện xử lý: dịch trái ca cao lên men tự nhiên
Hình dạng nấm men phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Thành phố (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 13)
Hình 13. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Thành phố (Bến Tre)
* Ghi chú: (a) oval lớn (HBT1), (b) elip dài (HBT2), (c) cầu lớn (HBT3)
Kết quả phân lập cho thấy từ dịch trái ca cao lên men tự nhiên ở Thành phố (Bến Tre) đã phân lập được 3 dòng nấm men là: oval lớn, elip dài và cầu lớn khác nhau.
Nấm men hình oval lớn có khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn bóng, rìa nguyên, kích thước 4 mm.
Nấm men hình elip dài có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, mô nổi, bề mặt khô sần, rìa nguyên, kích thước 4 mm.
Nấm men hình cầu lớn có khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.
* Điều kiện xử lý: hạt ca cao được nuôi tăng sinh
Hình dạng nấm men phân lập từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Thành phố (Bến Tre) và được nuôi ủ 3 ngày trên môi trường PGA (Hình 14).
(c) (b)
Hình 14. Hình dạng tế bào nấm men (vật kính 100) phân lập từ hạt ca cao
được nuôi tăng sinh ở Thành phố (Bến Tre)
Kết quả phân lập cho thấy từ hạt ca cao được nuôi tăng sinh ở Thành phố (Bến Tre) đã phân lập được dòng nấm men hình cầu lớn với khuẩn lạc tròn, mô núm, màu trắng sữa, bề mặt trơn láng, rìa nguyên, kích thước 3,5 mm.
Kết quả phân lập nấm men từ dịch lên men tự nhiên và hạt ca cao được nuôi tăng sinh (ở 3 địa điểm: Chợ Lách, Giồng Chôm và Thành phố - Bến Tre) thu được 18 dòng nấm men chủ yếu có các dạng: cầu, cầu nhỏ, cầu lớn, oval nhỏ, oval lớn, dài, elip ngắn và elip dài. Những dòng nấm men giống nhau có hình dạng và màu sắc khuẩn lạc giống nhau, còn kích thước khuẩn lạc dao động nhỏ.
4.1.2. Đặc điểm sinh lý của 18 dòng nấm men
4.1.2.1.Khả năng lên men 2 loại đường (glucose và saccharose)
Kết quả phân lập cho thấy có 13 dòng đều lên men đường glucose (trừ 5 dòng không lên men cả đường glucose và saccharose), có 8 nghiệm thức (HCL4, HBT1, HBT3, DGC1, DGC2, HGC1, HGC3 và DBT1) lên men đường saccharose. Riêng nghiệm thức HGC5 lên men đường saccharose yếu. Ngoài ra, có 9 nghiệm thức (DCL1, DCL2, HCL1, HCL2, HCL3, HBT2, HGC4, DGC3, HGC2) không lên men đường saccharose (Bảng 7).
Bảng 7. Khả năng lên men đường glucose và saccharose của 18 dòng nấm men phân lập
NT Đường Glucose Đường Saccharose
DCL1 Tạo bọt khí trên bề mặt, chiều cao cột khí CO2 đạt 2,0 – 2,1cm sau 72 giờ
lên men.
Không lên men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DCL2 Tạo bọt trắng trên bề mặt, chiều cao cột khí CO2 đạt 2cm sau 72 giờ lên men.
Không lên men.
HCL1, HCL2, HCL3, HBT2, HGC4
Không lên men. Không lên men.
HCL4 Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 10 giờ lên men.
Tạo bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 2,9 – 2,93 cm sau 24 giờ lên men.
HBT1 Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 6 giờ lên men.
Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 20 giờ lên men.
HBT3 Tạo nhiều bọt khí, có váng bám xung quanh ống nghiệm, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 8 giờ lên men.
Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 10 giờ lên men.
DGC1 Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 6 giờ lên men.
Tạo bọt khí trên bề mặt, chiều cao cột khí CO2 đạt 2,2 – 2,3 sau 72 giờ lên men.
DGC2 Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 10 giờ lên men.
Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 24 giờ lên men. DGC3 Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2
đạt 3cm sau 10 giờ lên men.
Không lên men.
HGC1 Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 24 giờ lên men.
Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 24 giờ lên men.
HGC2 Tạo bọt khí, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 18 giờ lên men.
Không lên men.
HGC3 Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 9 giờ lên men.
Tạo nhiều bọt khí nhỏ, chiều cao cột khí CO2 đạt 3cm sau 54 giờ sau lên