3.2.1. Chuẩn bị thí nghiệm
Mẫu đất lấy ở mỗi nơi 2 mẫu, mỗi mẫu 500g; lấy từ trên xuống dưới khoảng 5cm.
Thời gian thu mẫu: ngày 17/02/2013
Môi trường phân lập: MSB (mineral salts basal) theo công thức của Na et al., (2005).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.2. Phân lập vi khuẩn
Lấy 5g mẫu đất, nghiền mịn và trộn đều trong 2ml môi trường MSB rồi đem ủ trong chai 50 ml có nắp đậy kín, bên trong chai có chứa 1 tuýp toluene mở nắp ở điều kiện ủ là 45oC trong 1 tuần nhằm tăng sinh vi khuẩn phát triển ở điều kiện môi trường có Toluene.
Tiếp theo, 1ml dung dịch này được thêm vào chai 50ml có nắp đậy kín chứa 9ml môi trường MSB và 1 ml và 0,1 ml Toluene (10% và 1% v/v). Ủ chai ở 45oC và lắc 120 vòng/phút trong 5 ngày.
Sau đó, 1ml dung dịch này tiếp tục được chuyển sang 9ml môi trường MSB mới và ủ trong 2 ngày. Dung dịch này được pha loãng với 1 loạt các nồng độ khác nhau sau đó trải trên môi trường MSB agar và ủ trong tủ ủ với 1 cốc chứa Toluene.
Khi khuẩn lạc đã xuất hiện trên mặt đĩa, chọn những khuẩn lạc rời khác nhau cấy chuyển nhiều lần đến khi thu được những khuẩn lạc ròng.
Điều kiện ủ mẫu trong suốt quá trình phân lập là 45oC. Những khuẩn lạc thu được trên môi trường này được kiểm tra bằng cách ủ trở lại trong môi trường lỏng để xác định khả năng phân hủy Toluene (Na, 2005; Faizal et al., 2005).
3.2.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường MSB agar
Sau khi phân lập và tách ròng các dòng vi khuẩn trên môi trường MSB agar, tiến hành quan sát các khuẩn lạc rời và mô tả các đặc điểm: kích thước, hình dạng khuẩn lạc, độ nổi, màu sắc của khuẩn lạc… (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng. Các dòng vi khuẩn đã phân lập sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo phương pháp giọt ép. Phương pháp này cho phép thấy sự chuyển động của vi khuẩn bằng cách:
- Nhỏ 10μl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. - Dùng lamen đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với kính mang vật một góc 45o đặt nhẹ nhàng tránh không cho có bọt khí.
- Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để thấy hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn
Các dòng vi khuẩn sau khi quan sát sự chuyển động trong môi trường nước cất vô trùng được tiếp tục đo kích thước tế bào dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần bằng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002)
Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: Nhỏ 10 μl nước cất vô trùng lên giữa kính mang vật.
Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn cho lên giọt nước vô trùng trên kính mang vật, trải mẫu thật đều và mỏng trên toàn bộ kính mang vật, cố định mẫu bằng cách hơ kính mang vật có sẵn vi khuẩn trên ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ từ 1 đến 2 giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi khuẩn đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Nhỏ từ 1 đến 2 giọt dung dịch iod và trải đều bằng que cấy, để yên trong 1 phút. Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu đến khi giọt cuối cùng không còn màu tím nữa. Dung dịch này có tác dụng rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm trở mất màu.
Tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. Nhuộm tiếp với Fushin, nhỏ từ 1 đến 2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy, để yên trong 1 phút. Cả 2 nhóm vi khuẩn đều bắt màu thuốc nhuộm này, nhưng vi khuẩn
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gram dương không bị đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên hồng đỏ. Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến khi giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ lửa cho khô nước.
Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận kết quả. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là vi khuẩn Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là vi khuẩn Gram âm.
3.2.4. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene
Các dòng vi khuẩn sau khi phân lập từ các mẫu khác nhau được nhân giống và cấy chuyển ra các ống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi lắc từng dòng trên môi trường MSB lỏng chứa 0,01% yeast extract, ở 45oC, tốc độ lắc 120 vòng/phút với tỉ lệ 1% giống để tăng sinh vi khuẩn.
Chủng vi khuẩn đã nuôi lắc vào môi trường MSB có chứa Toluene ở các nồng độ 0%, 1%, 1,5%, 2%. Đo sự thay đổi độ đục OD(600 nm) để xác định dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Toluene trong các ngày 0, 2, 4.
3.2.5. Khảo sát khả năng tạo một số enzyme
Sau khi tuyển chọn các dòng vi khuẩn, tiếp tục tiến hành khảo sát hoạt tính của một số enzyme như: protease, cellulase, amylase và lipase.
* Khảo sát khả năng tạo enzyme protease - Môi trường: MSB agar có skim milk (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5μl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có skim milk (2%) và ủ ở 45oC. Đo đường kính vùng sáng quanh khuẩn lạc sau 1, 2, 3 ngày để xác định khả năng tổng hợp enzyme protease của vi khuẩn.
* Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase
- Môi trường: MSB lỏng có bổ sung dầu ăn (2%)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
(2%) đặt trên máy lắc 120 vòng/phút trong 2-3 ngày ở 45oC. Đo OD600nm các ngày 0, 2 và 4 để xác định khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn trong môi trường chứa 2% dầu ăn của vi khuẩn.
* Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase
- Môi trường: MSB agar có bổ sung tinh bột (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5μl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có tinh bột (2%). Sau 2 ngày ủ ở 45oC cho dung dịch Iod phủ lên bề mặt thạch. Enzyme amylase do vi khuẩn tổng hợp sẽ thủy phân tinh bột trong môi trường, phần tinh bột không bị thủy phân tác dụng với dung dịch Iod tạo thành màu xanh đen.
* Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase - Môi trường: MSB agar có CMC (2%)
- Cách tiến hành: Vi khuẩn nuôi trong môi trường LB lỏng qua đêm sau đó nhỏ 5μl dung dịch vi khuẩn lên môi trường MSB agar có CMC (2%). Sau khi ủ vi khuẩn 2- 3 ngày phủ lên bề mặt agar dung dịch Iodine và đo đường kính vòng sáng xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn.
3.2.6. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Căn cứ vào kết quả của thí nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ và các kiểm tra sinh hóa để chọn ra 03 dòng vi khuẩn có tiềm năng cao. 03 dòng vi khuẩn này sẽ được gởi giải trình tự tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.
3.2.7. Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy dung môi hữu cơ
Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức bao gồm nghiệm thức đối chứng và ba nghiệm thức còn lại là ba nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau, được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại.
Chuẩn bị các nghiệm thức (môi trường lỏng):
- Pha môi trường MSB cho lần lượt vào các ống nghiệm, mỗi ống thể tích 5ml, đậy nắp sau đó đem khử trùng ở nồi khử trùng nhiệt ướt ở 121o
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Để nguội môi trường sau đó tiến hành chủng dòng vi khuẩn vào các ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Ở mỗi thí nghiệm, thể tích vi khuẩn được chủng vào các nghiệm thức cũng như các lần lặp lại là 500 µl (mật độ 2.102 CFU/ml)
- Dung môi hữu cơ được cho trực tiếp vào môi trường ở các nghiệm thức dưới dạng dung dịch lỏng theo những thể tích đã được mô tả ở bảng 4.
- Các nghiệm thức sau khi được tiến hành như trên được giữ trên máy lắc, 120 vòng/phút ở 45oC (điều kiện hiếu khí) trong suốt quá trình theo dõi.
- Chuẩn bị môi trường MSB agar đếm mật số vi khuẩn: Môi trường MSB lỏng được bổ sung thêm agar 1,8 đến 2g/100ml môi trường để có môi trường MSB agar trong đĩa Petri. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4: Các nghiệm thức sử dụng trong thí nhiệm
NT1 NT2 NT3 NT4 500µl VK + 0% VToluene 500µl VK + 1% VToluene 500µl VK + 1,5% VToluene 500µl VK + 2% VToluene
Ghi chú: V: thể tích; VK: vi khuẩn; NT: nghiệm thức)
* Tiến hành pha loãng và đếm mật số.
Để xác định mật số vi khuẩn ở từng nghiệm thức ta tiến hành pha loãng, nhỏ giọt và đếm mật số trong các ngày 0, 2, 4, 6.
Pha loãng môi trường có chứa vi khuẩn thành các nồng độ thấp hơn. Từ ống nghiệm, hút 100µl dung dịch có chứa vi khuẩn cho vào eppendoft đã có sẵn 900 µl nước cất tiệt trùng. Tiếp tục thực hiện một loạt pha loãng từ 10-1 đến 10-9 (Hình 2). Chọn các nồng độ 10-2 đến 10-9 để tiến hành nhỏ giọt. Dung dịch pha loãng sẽ được hút 3 giọt, mỗi giọt 5 µl rồi nhỏ lên bề mặt đĩa Petri đã đổ sẵn môi trường MSB agar, để những giọt dung dịch cho khô trên môi trường agar, sau đó đem ủ ở 45oC. Sau 48 giờ (hoặc khi quan sát thấy các khuẩn lạc đã mọc lên) tiến hành đếm số khuẩn lạc được hình thành ở các nồng độ pha loãng khác nhau (dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc vi sinh vật trong dung dịch ban đầu).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml (CFU/ml) trong dịch nuôi ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D1 được tính theo công thức là:
Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong đó:
Ai là số khuẩn lạc trung bình/giọt Di : độ pha loãng
V: dung tích huyền phù tế bào trong mỗi giọt (ml)
Hình 2: Nguyên tắc pha loãng
Xử lý số liệu: dùng chương trình Excel xử lý vẽ biểu đồ, phần mềm thống kê
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
Sau quá trình phân lập tách ròng, 9 dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy được Toluene đã được phân lập từ 4 mẫu đất được lấy từ các 04 nguồn (Nhà máy thuộc da Tây Đô, xí nghiệp nhựa Cần Thơ, hồ Xáng Thổi, ruộng lúa) có nguy cơ nhiễm Toluene trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Trong đó, 07 dòng có nguồn gốc từ nhà máy thuộc da Tây Đô và 02 dòng có nguồn gốc từ Hồ Xáng Thổi. Thông tin chi tiết về nguồn gốc của các dòng được trình bày trong bảng 5.
Bảng 5: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập
Stt Dòng vi khuẩn Nguồn gốc mẫu
01 T3 Nhà máy thuộc da Tây Đô
02 T4 Nhà máy thuộc da Tây Đô
03 T9 Nhà máy thuộc da Tây Đô
04 T12 Nhà máy thuộc da Tây Đô
05 T14 Nhà máy thuộc da Tây Đô
06 T34 Hồ Xáng Thổi
07 T38 Hồ Xáng Thổi
08 T50 Nhà máy thuộc da Tây Đô
09 T51 Nhà máy thuộc da Tây Đô
Đa số các dòng vi khuẩn có thời gian phát triển khá chậm (trung bình từ 48 đến 72 giờ). Hình dạng khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn được thể hiện trong hình 2.
4.2. Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn này có dạng tròn, bìa nguyên hoặc răng cưa, độ nổi lài hoặc nhô, đa số màu trắng đục chỉ có một dòng T4 có màu trắng trong, đường kính khuẩn lạc sau 48 tiếng phát triển dao động từ 0,1mm đến 1,5 mm. Chi tiết kích thước, hình dạng, dạng bìa, độ nổi, màu sắc của các khuẩn lạc được nêu chi tiết trong bảng 6.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Stt Dòng vi khuẩn
Kích thƣớc (Đƣờng kính)(mm)
Hình dạng Hình dạng
bìa Độ nổi Màu
01 T3 0,1 Tròn Nguyên Nhô Trắng đục
02 T4 0,8 Tròn Nguyên Nhô Trắng trong
03 T9 0,2 Tròn Nguyên Nhô Trắng đục
04 T12 0,2 Tròn Nguyên Nhô Trắng đục
05 T14 1,5 Không đều Răng cưa Lài Trắng đục
06 T34 0,15 Không đều Nguyên Lài Trắng đục
07 T38 0,1 Tròn Nguyên Nhô Trắng đục
08 T50 1 Không đều Răng cưa Lài Trắng đục
09 T51 1,5 Không đều Răng cưa Lài Trắng đục
Bảng 7: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn đã phân lập
St t Dòng vi khuẩn Chiều dài (µm) Chiều rộng (µm) Hình dạng Gram Khả năng di chuyển (*) 01 T3 1,3 0,37 Que Âm + 02 T4 1,5 0,62 Que Âm + 03 T9 1,87 0,37 Que Âm + 04 T12 2,37 0.12 Que Âm + 05 T14 1,25 0,75 Que Âm + 06 T34 1,87 0,25 Que Âm + 07 T38 1,25 0,62 Que Âm + 08 T50 2,5 0,25 Que Âm + 09 T51 1,25 0,37 Que Âm +
Ghi chú: *: Không có khả năng di chuyển (-); có khả năng di chuyển (+)
Khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần, tất cả tế bào vi khuẩn đều ở dạng hình que với chiều dài biến thiên từ 1µm đến 1,9 µm và chiều rộng biến thiên từ 0,1 µm đến 0,6 µm. Kết quả nhuộm Gram cho thấy 100% các dòng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram âm (Bảng 7). Các nghiên cứu trước đây cũng đã phân lập được các dòng vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas Gram âm có khả năng phân hủy dung môi hữu cơ (Matsumoto et al., 2002).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 4: Kết quả nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn
4.3. Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân hủy Toluene Toluene
Các dòng vi khuẩn đã được phân lập được theo dõi sự phát triển trong môi trường có chứa Toluene như nguồn carbon duy nhất với nồng độ khác nhau (0%, 1,5%, 2%). Theo kết quả đo OD, qua các ngày 0, 2, 4, ta nhận thấy đa số các dòng vi khuẩn đều có chỉ số OD giảm ở ngày 02. Nguyên nhân cho việc giảm chỉ số OD có thể là do ở ngày 02, khả năng thích nghi của vi khuẩn đối với Toluene chưa cao và một số vi khuẩn bị chết do thay đổi môi trường đột ngột khi có chỉ có Toluene như nguồn carbon duy nhất. Sau ngày 4, giữa các dòng đã có sự khác biệt khá rõ ràng, bên cạnh