Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcohol acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchsin, nhờ đó mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl Neelsen. (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn.
2. Chuẩn bị
- Hoá chất: Các thuốc nhuộm Ziehl Neelsen: fuchsin kiềm với phenol; cồn acid, xanh methylen blue. Bộ thuốc nhuộm kháng acid được chứa trong các chai sẩm màu, nắp vặn chặt, giữ trong tối ở nhiệt độ phòng.
- Bệnh phẩm: Đờm hoặc các dịch khác như dịch màng não, dịch màng phổi…
3. Cách tiến hành
- Trước hết đánh dấu tiêu bản.
- Cố định tiêu bản bằng cách nhỏ 1 giọt cồn 90[sup]0[/sup] lên tiêu bản rồi đốt cháy cồn hoặc hơ qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần.
- Phủ thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl kín hết diện tích dàn, bệnh phẩm, dùng que bông cồn đốt cháy nhẹ dưới lam kính đến khi trên mặt đồ phiến bốc hơi thì thôi, đốt như vậy 3 lần. Rửa dưới vòi nướ chảy nhẹ.
- Tẩy màu với hỗn hợp cồn acid bằng cách nhúng tiêu bản vào bình chứa cồn acid, khi nào đưa lên chỉ còn vết đỏ nhạt là được.
- Rửa nước
- Nhuộm xanh methylen 30 giây, rửa nước, để khô soi kính hiển vi.
4. Đọc kết quả
- Quan sát phết nhuộm kháng acid qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, trực khuẩn kháng acid bắt màu đỏ cánh sen, mảnh, còn vi khuẩn thường cũng như các nền khác như tế bào biểu mô hay bạch cầu bắt màu xanh.
- Khi trả lời một kết quả nhuộm kháng acid, không được kết luận là dương tính M. tuberculosis mà chỉ trả lời là có hiện diện trực khuẩn kháng acid.
5. Các sai lầm kỹ thuật có thể gặp trong phương pháp nhuộm kháng acid
- Phết nhuộm quá dày sẽ làm alcohol acid không thể tẩy hết màu carbolfuchsin, vì vậy những trực khuẩn không kháng acid vẫn bắt màu đỏ cánh sen. Tuy nhiên được có thể phân biệt đây không phải là vi khuẩn kháng acid khi quan sát màu vùng nhầy hay tế bào biểu mô hay bạch cầu xung quanh vẫn còn màu đỏ chứng tỏ màu không bị tẩy hết. Ngoài ra, trực khuẩn không có hình dạng tiêu biểu của trực khuẩn kháng acid: mập, không mảnh khảnh như trực khuẩn kháng acid thực sự.
- Màu carbolfuchsin bị cặn, sẽ đóng lên phết nhuộm làm alcohol acid không thể tẩy hết màu và do vậy vi khuẩn thường vẫn nhuộm màu đỏ cánh sen như trên. Để tránh tình trạng này, phải thường xuyên lọc màu qua giấy lọc mỗi khi kiểm tra nhỏ màu carbolfuchsin lên một lam trống thấy có cặn sau khi đổ bỏ carbolfuchsin khỏi lam.
- Để tránh các sai lầm trên, nên nhuộm kiểm tra chất lượng trước mỗi lô thuốc nhuộm mới pha và định kỳ mỗi tháng một lần đối với lô thuốc nhuộm đang sử dụng.
CẤY VI KHUẨN VÀO CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG