Sau khi học xong bài này, học sinh có khả năng:
1- Trình bày đúng phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ ánh sáng. 2.Trình bày đúng quy trình sử dụng, bảo quản máy đo quang.
3.Thao tác đúng qui trình vận hành máy đo quang .
Nội dung:
I. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DỰA TRÊN SỰ HẤP THỤ ÁNH SÁNG . 1. Định luật Lambert- beer: Dựa trên cơ sở vật lý sau:
- khoảng cách giữa vùng phổ và bước sóng được quy định :
Bước sóng <100n m →200n m →360n m →1000nm →50µ m →30cm →10 m >10m Vùng phổ Tia vụ trụ Tia x,γ Tử ngoại xa (chân không) Tử ngoại gần ánh sáng khả biến ( 7 sắc cầu vồng) Hồng ngoại gần Hồng ngoại xa Vi sóng Sóng vô tuyến điện
Khi chùm tia sáng có phổ liên tục từ cực tím đến hồng ngoại ( 200 - 1000nm ) qua một chất đồng nhất ( qua một dung dịch, thì chùm tia ló ra sẽ có phổ khác với chùm tia đi vào ( tia tới ) như vậy ánh sáng đã bị hấp thụ . Mỗi chất chỉ hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng nhất định, còn ánh sáng ở bước sóng khác sẽ đi qua.
- Nếu chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ Io qua một lớp dung dịch có nồng độ hoàn tan (C ), có chiều dầy là L thì một phần của chùm tia sẽ bị dung dịch hấp thụ, một phần bị phản xạ hoặc khuếch tán , phần còn lại có cường độ It sẽ đi qua
Chùm tia tới Chùm tia ló
Io Ia It
- Định luật Lambert: Khảo sát sự hất thụ ánh sáng của một dung dịch có nồng độ không thay đổi khi thay đổi chiều dày của lớp dung dịch hấp thụ, có phương trình sau:
It = Io . e- KCL
- Định luật Beer: Nghiên cứu sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi thay đổi nồng độ chất hoà tan còn bề dầykhông thay đổi . Ta có phương trình .
It = Io . eKC
ở đây K là hệ số tắt . Hệ số này chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hoà tan và bước sóng của chùm tia tới .
ta có : K = ε.C (ε là1 hệ số không phụ thuộc vào nồng độ ) - Kết hợp 2 phương trình của 2 định luật trên ta có được; Định luật Lambert - berr có phương trình tổng quát sau: It = Io-εCL
- Tỉ số giữa cường độ của chùm tia ló ( It ) và cường độ của chùm tia tới Io được gọi là độ truyền qua - độ thấu quang: T ( Transmitance).
-A là độ hấp thụ quang: Absorbance
( còn gọi là mật độ quang : optical density- OD.)
Trong trường hợp bề dầy dung dịch bằng 1 cm, T được gọi là hệ số truyền qua. Logarit của đại lượng nghịch đảo của độ truyền qua được gọi là hệ số tắt ký hiệu là E
1 Io E(OD hoặc A ) = lg = lg =εcl
T It E = ε cl
- Như vậy với một dung dịch có bề dầy không đổi thì E sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ chất hoà tan trong dung dịch nếu biết E sẽ suy ra nồng độ chất hoà tan.
- Phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ ánh sáng là phương pháp xác định nồng độ của các dung dịch bằng cách đo mặt độ quang của nó.
CL o t e I I I = = −ε
1- Dùng ánh sáng thường nhưng lọc qua các kinh lọc màu để có các bức xạ sóng nằm trong một khoảng hẹp về độ dài sóng. Đó là phương pháp đo màu hoặc đo quang ( dùng ánh sáng thường )
2- Dùng chùm tia đơn sắc. Gọi là phương pháp quang phổ hấp thụ
Định luật Lam bert - beer chỉ nghiệm thật đúng khi dùng ánh sáng đơn sắc cho nên phương pháp quang phổ hấp thụ là chính xác nhất.
2. Phương pháp đo màu (đo quang ):
Trong phương pháp này người ta dùng các bức xạ nhìn thấy vì vậy chỉ được áp dụng để đo các chất có màu hoặc đã được chuyển thành những chất màu bằng cách cho kết hợp với những chất thử thích hợp.
Ta có: E = ε cl
Như vậy với một lớp dung dịch có chiều dày không đổi, mật độ quang tỉ lệ thuận với nồng độ chất hoà tan người ta đo mật độ quang của dung dịch chuẩn vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ. Sau khi có mật độ quang của dung dịch thử đối chiếc với đồ thị chuẩn để tìm ra nồng độ của dung dịch thử .
Mật độ quang được đo trên các điện quang kế có các tế bào quang điện là dụng cụ trong đó quang năng được chuyển thành điện năng. Người ta đo cường độ dòng quang điện để biết mật độ quang của dung dịch thử từ đó suy ra nồng độ của nó.
Có thể dùng một dãy ống mẫu có nồng độ biết trước ,so màu với ống thử để suy ra nồng độ của ống thử(gọi là cách so màu bằng mắt thường)
Có nhiều loại máy điện quang kế. - Loại 1 tế bào quang điện. Độ nhạy kém
- Loại 2 tế bào quang điện. Nhậy và ổn định hơn. Phương pháp đo màu quang điện là phổ biến .
Sơ đồ máy điện quang kế có một tế bào quang điện .
(7sắc cầu vồng đó là:Đỏ-da cam-vàng -lục-lam-chàm-tím) <630-760nm> <400-430nm>
Màu của dung dịch đo. Kính lọc
- Đỏ, da cam Xanh, xanh ve
- Xanh Đỏ
- Màu ve Đỏ - Đỏ tía Ve - Vàng Tím
Máy phải sử dụng bộ phận khuếch đại dòng quang điện và dòng điện này được đo lường bởi một điện kế hoặc một bộphận đã chuyển đổi từ cường độ dòng quang điện trực tiếp ra mặt độ quang E và độ truyền qua T . Điện quang kế hiện đang được sử dụng. Còn có bộ phận tính ra kết quả trực tiếp của nồng độ chất thử và ghi ra máy tính gắn liền vào máy.
3. Phương pháp quang phổ hấp thụ : Sử dụng nguồn sáng là tia đơn sắc nên có độ chính xác cao hơn phương pháp đo quang. Nó có khả năng xác định được hai hợp chất có độ hấp thụ ở các bước sóng gần nhau mà phương pháp đo quang khó phân biệt được trong các máy hoá sinh thường áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ điện tử
( các phổ tử ngoại và khả kiến )
3.1. Máy quang phổ hấp thụ: - Nguồn sáng:
+ Vùng khả kiến dùng bóng đèn dây tóc tungsten ( chophổ phát xạ liên tục từ 320 - 1000nm )
+ Vùng tử ngoại: Dùng bóng đèn thạch anh thường là bóng đèn hydro ( cho phổ phát xạ liên tục từ 200- 360nm ) .
- Bộ phận đơn sắc: Để có được những chùm tia đơn sắc người ta dùng :
+ Lăng kính: Kính lăng trụ có 3 mặt phổ có bước sáng rộng từ vùng tử ngoại →
hồng ngoại .
+ Cách tử: Cấu tạo là một lá nhôm mỏng có nhiều khía có tác dụng tán xạ ánh sáng mạnh hơn lăng kính
-Ống nhân quang điện tử:
Có vai trò trong khâu chuyển quang năng thành điện năng ( gọi là tế bào quang điện )
- Kính lọc.
- Cóng đựng dung dịch(cuvete):1cm ; 0,5cm cóng làm bằng thuỷ tinh ( OS ) .thuỷ tinh thạch anh ( QS) .
- Bộ phận ghi với những thang điện kế ghi ra mật độ quang và độ truyền qua từ đó qua bộ phận sử lý cho ra kết quả vào máy tính .
- Các chất thường có phổ hấp thụ rất khác nhau do đó người ta thường dùng phổ hấp thụ để xác định, định tính các chất hoặc thử độ tinh khiết của các chất .
- Để định lượng các chất người ta đo mặt độ quang của dung dịch đó với tia sáng có độ dài sóng nhất định ( thường là độ dài sóng ở đó sự hấp thụ là cức đại - λmax )
Ví dụ: - Protein được đo ở bước sóng 543nm - acid nucleic đo ở bước sóng 260nm
- NADH2 được đo ở bước sóng 340nm
Sau khi có E, nồng độ các chất được tính theo công thức :
E C = εl
Hệ số ε có thể tính được bằng cách đo mật độ quang của dung dịch . Có nồng độ và chiều dày biết trước và tính theo công thức sau: E
ε = Cl
Khi C = 1 mol/ l; l= 1 cm thì (ε = E ) mật độ quang đo được chính là hệ số hấp thụ phân tử
Nếu C = 1g/ dl; l = 1cm thì E đo được là hệ số hấp thụ riêng.
* Như vậy : + Hệ số hấp thụ phân tử là mật độ quay của một dung dịch có nồng độ 1 mol/l và bề dày bằng 1cm.
+ Hệ số hấp thụ riêng là mật độ quang của 1 dung dịch có nồng độ là 1g/dl và bề dày 1cm có ký hiệu là E
- Nếu biết được hệ số hấp thụ phân tử hoặc hệ số hấp thụ riêng thì ta có thể tính được nồng độ của dung dịch thử sau khi đo mật độ quay mà không cần so sánh với dung dịch chuẩn hay biểu đồ chuẩn như trong phương pháp đo quang
II.CÁC LOẠI MÁY ĐO QUANG: Có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau tuỳ theo hãng sản xuất .
Có 3 phép đo quang:
• Phép đo điểm cuối (End point): Là phép đo mật độ quang của ống thử trong quá trình phản ứng sau một thời gian nhất định phản ứng xảy ra hoàn toàn, tạo một phức hợp màu đặc trưng. Mật độ quang đo được tại điểm kết thúc tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch.
• Phép đo động học hai điểm (Two point kinetic, fixed time):
Khiphản ứng không tuyến tính,không xác định được điểm cuối Trong xét nghiệm Ure và Creatinin thườg dùng phương pháp này.
• Phép đo động học enzym (enzymmatic kinetic)
Phép đo này sử dụng khi xét nghiệm về enzym. Phản ứng không tạo phức hợp màu mà chỉ làm độ đục của dung dịch trong khoảng thời gian nhất định. Việc xác định hoạt độ của enzym không thể xác định bằng phép đo điểm cuối hay phép đo động học hai điểm mà phải xác định ở nhiều thời điểm khác nhau. Phép đo này tính hoạt độ enzym phải thông qua việc xác định hiệu số mật độ quang trung bình
∆D gọi là phép đo Kinetic.
∆D1 = D2 - D1
∆D2 = D3 - D2 Σ∆D
∆D3 = D4 - D3 ⇒∆D =
∆D4 = D5 - D4 n
Hoạt độ enzym U/l = ∆D x K (Hệ số K do hãng sản xuất hóa chất xác định).
Có thể đo sự giảm mật độ quang (định lượng GOT, GPT) hoặc sự tăng mật độ quang (định lượng amylase).
1. Máy quang phổ kế: máy thường có từ 1 - 4 cóng đo. Thường có 7 bước sóng thông thường từ 480 - 720nm.
Đồng hồ đo thường có 2 thang: thang đỏ, thang đen. - Thang đỏ: Chỉ E ( mật độ quang )
- Thang đen: Chỉ T ( độ thấu quang ) Io 1 Ta có công thức: Lg = Lg It T
- Nếu khi ta đo ống nước cất
ánh sáng không bị hấp thụ lại. Độ thấu quang T = 100%, lúc này mật độ quang bằng 0 : 1 E = lg = lg 1 = 0 100% 1 - Nếu T = 50%→ E= lg = lg2 = 0,3 50% - Nếu T = 10% → E = lg 1/10% = lg 10 = 1 - Nếu T = 1% → E = lg 1/1% = lg 100 = 2 - Nếu T= 0% → E = lg 1/0% = lg 100/0= ∝ 1.1.Quy trình sử dụng:
1- Cắm phích điện qua ổn áp ( điện 220 V )
2- Bật công tắc máy - để máy nóng ( chờ 5- 10 phút )
MĐQ D1 D 2 D3 D4 D5 0 T 1 T 2 T 3 T4 T 5 Thời gian
4- Lắc đều dung dịch đổ vào cóng đo ( cóng phải sạch khô- có thể tráng bằng dung dịch định dùng ). chỉ đổ 2/3 cóng, không đổ đầy dung dịch sẽ tràn ra làm ướt máy, hỏng máy. Nếu đổ ít quá ánh sáng sẽ không chiếu qua được cóng dung dịch định đo.
5- Đặt ống đúng vị trí ( cóng nước cất → cóng ống trắng → cóng ống mẫu →
cóng ống thử) . Theo thứ tự từ nhạt màu đến đậm màu. 6- Tiến hành đo.
7- Đo xong, tráng rửa cóng bằng nước cất, lau máy, tắt máy, rút phích điện.
1.2. Bảo quản:
1- Lau máy bằng khăn khô,chụp máy bằng mũ vải mềm tránh bụi.
2- Cóng phải để trong hộp kín, lau cóng bằng khăn mềm, không làm sước cóng. 3- Hàng ngày phải cắm sấy máy 5 -10 phút ( đặc biệt khi thời tiết ẩm.)
4- Tránh động chạm mạnh vào máy; hạn chế việc di chuyển máy.
5- Khi đo máy lâu <nóng máy > phải tắt máy một lúc rồi mới tiếp tục đo để để bảo vệ máy.
6- Phải cắm điện qua ổn áp để bảo vệ máy đề phòng sự thay đổi nguồn điện đột ngột làm hỏng máy.
7- Khi máy có sự cố hỏng hóc phải báo thợ chuyên sửa máy để sửa chữa. Tuyệt đối không tự ý sửa .
2. Máy quang kế bán tự động
2.1. Nguyên lý hoạt động: Đo độ hấp thụ màu của từng dung dịch nhờ hệ thống quang học có kính lọc màu cho chùm tia đơn sắc thích hợp với từng dung dịch đo. Thông qua hệ thống máy vi tính cho ta biết kết quả ngay.
2.2. Cấu tạo
1- Bộ phận quang học ( giống máy quang kế thường ). 2- Bộ phận vi tính ( máy in - đĩa mềm ).
3- Hệ thống ống hút, thải dung dịch. 4- Bàn phím, nút bấm hút.
5- Công tắc máy, cấu trì, bộ lựa chọn điện thế, hệ thống ống thải ( phía sau của máy)
2.3. Quy trình vận hành Máy RA-50 . Đo mật độ quang (Absorbance ).
1- Cắm phích điện qua ổn áp.
2- Bật công tắc máy - chờ máy kiểm tra ( khoảng 1 phút ) - máy hiện về ngày tháng năm trên màn hình - tiến hành đo.
4- Nhấn vào số 1 - chọn bước sóng thích hợp.
5- Nhấn vào số 0 - đồng ý bước sóng trên màn hình.
6- Máy in chương trình ra giấy ( nếu không in nhấn nút Abort ). 7- Nhấn nút Rince ( rửa máy bằng nước cất ).
8- Đo ống trắng ( ấn nút màu vàng ). máy sẽ hút dung dịch cần đo ).
9- Tiếp tục ấn nút màu vàng để đo các ống mẫu - thử 1- thử 2…..( nên đo từ ống nhạt màu đến ống đậm màu để tránh sai số ).
10- Khi đo xong nhấn nút Rince để rửa máy bằng nước cất - dung dịch rửa - nước cất. <Để tráng sạch đường ống .>
11- Tắt công tắc máy ( phía sau máy ). Rút phích điện. Lau máy bằng khăn sạch khô, mềm.
Đo theo quy trình mới
1- Cắm phích điện qua ổn áp .
2- Bật công tắc máy - chờ máy kiểm tra - máy hiện về ngày tháng năm trên màn hình - tiến hành đo.
3- ấn vào mã cần đo ( protein, glucose…..).
4- Sau khi đã lập trình cài đặt các dữ liệu theo hướng dẫn của tờ giấy đặt trong hộp thuốc thử khi mua về - máy sẽ in ra toàn bộ chương trình ta cài đặt sẵn ( nếu không muốn in nhấn nút Abort.
5- Nhấn nút Rince ( rửa máy ).
6- ấn nút vào đển đo các ống : Trắng - mẫu - thử. ( đo từ ống nhạt màu đến ống đậm màu ) 7- Khi đo song, nhấn nút Rince để rửa máy. 8- Tắt công tắc máy, rút phích điện, lau máy .
2.4. Bảo quản.
1- Sau khi đo song tuyệt đối phải tráng rửa đường ống sạch sẽ tránh hiện tượng tắc đường ống do các dung dịch đo.
2- Tuyệt đối không đo các dung dịch có cặn đục, dung dịch acid đậm đặc làm hỏng đường ống.
3- Khi máy đang kiểm tra ( màn hình nhấp nháy ) tuyệt đối không được nhấn các nút gây hỏng máy.
4- Khi không đo tắt máy để tránh hiện tượng nóng máy - cháy bóng đèn Halogen.
5- Phải cắm máy qua ổn áp. Để máy trong phòng điều hoà nhiệt độ - thường xuyên hút ẩm trong phòng.
7- Lau chùi máy thường xuyên chụp máy bằng vải mềm tránh bụi.
8- Hạn chế việc di chuyển máy. Khi vận hành máy động tác phải nhẹ nhàng, hạn chế việc đụng chạm mạnh vào máy.
3. Máy quang kế tự động .( về cơ bản giống máy quang kế bán tự động ).
Máy có thêm bộ phận cơ học ( bơm hút bệnh phẩm, thuốc thử sang khay phản ứng gồm nhiều khay nhỏ ,sau đó máy sẽ hút sang cóng đo phía trong máy (có loại máy đo trên nhiều cóng phản ứng cho từng xét nghiệm), cùng một lúc có thể xét nghiệm rất nhiều mẫu thử, nhiều loại phản ứng).
- Người vận hành cài đặt chương trình cho máy , xếp đặt các mẫu bệnh phẩm, thuốc thử ,theo thứ tự quy định. Máy sẽ tự hút, thực hiện phản ứng, in ra kết quả ngay.
Máy gồm các bộ phận sau: 1. Máy in
2. Máy vi tính 3. Máy đo quang
4. Khay đặt bệnh phẩm
5. Khay đặt thuốc thử , bình đựng dung dịch rửa