Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thực nghiệm.

THỰC NH ỆM VÀ PHƯƠN PHÁP NH ÊN CỨU 2.1 N u n liệu, ất v t iết bị n i n ứu

2.2.4.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư thực nghiệm.

ung thư thực nghiệm.

2.2.4.3.1. Thiết ị nghi n c u

Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250

C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.

2.2.4.3.2. Các dòng tế ào

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB

(Human epidermic carcinoma) - ung thư biểu mô, Hep G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan; LU (Human lung carcinoma) – ung thư phổi và

MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.

2.2.4.3.3. Phương pháp

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.

Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ được sử dụng để thử độc tính.

Thử độc tế bào: 200l dung dịch tế bào được pha loãng ở nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU. Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt

18

đến nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32g/ml; 8g/ml; 2g/ml; 0,5g/ml. Ủ 370C, 5% CO2 3 ngày. Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3x104

tế bào/ml. Ellipticine (Sigma) được dùng làm chất tham khảo ( đối chứng âm).

Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/ml ở 370C trong 4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.

Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

ODmẫu thử - ODcontrol(+) IC(%) = 100x ___________________________ ODcontrol(-) - ODcontrol(+)

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.