II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PC
3.4.5. Phương pháp phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15
3.4.5.1. Chuẩn bị tế bào
Do PCV2 nhân lên trong nhân của tế bào nên virus chỉ nhân lên trong kỳ phân chia của tế bào. Vì vậy, ựể tạo ựiều kiện cho virus nhân lên mạnh trên tế bào, cần sử dụng tế bào "non", với mật ựộ tế bào phủ ựáy khoảng 30 - 50%.
3.4.5.2. Chuẩn huyễn dịch bệnh phẩm 10%
- Dùng cối chày sứ ựồng nhất hoàn toàn huyễn dịch bệnh phẩm, sau ựó bổ sung DMEM không có FBS (PBS 1X) thành huyễn dịch 10%.
- Chuyển huyễn dịch bệnh phẩm vào ống eppendorf 1,5ml
- Ly tâm 4000 vòng/phút/4oC/10 phút.
- Dùng seringe hút phần dịch trong sau ly tâm.
3.4.5.3. Gây nhiễm tế bào
- Dùng lọc vô trùng 0.25um lọc khoảng 3 giọt (100 - 200ul) huyễn dịch bệnh phẩm 10% vào 1 giếng của ựĩa 24 giếng, mỗi mẫu bệnh phẩm gây nhiễm cho 4 giếng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
- Ký hiệu mẫu, ngày phân lập, loại tế bào, tình trạng phân lập (vắ dụ như isolation, passage 1 hoặc passage 2, ...).
- Nghiêng ựĩa tế bào theo chiều ngang ựể ựồng nhất huyễn dịch bệnh phẩm
và tế bào. Tránh làm tế bào cụm vào giữa ựĩa.
- Ủ huyễn dịch bệnh phẩm + tế bào: 37oC/5%CO2/ 60 phút
- Loại bỏ toàn bộ dung dịch bên trong các giếng.
+ Lưu ý: trường hợp quan sát thấy tế bào ựã bám và vươn ra mặt ựĩa (không có dạng co tròn bám trên mặt ựĩa), có thể rửa bằng 500ul PBS 1X/ giếng ựể loại bỏ hoàn toàn huyễn dịch gây nhiễm).
- Bổ sung môi trường nuôi cấy tế bào: 500ul - 1000ul/giếng/ựĩa 24 giếng.
3.4.5.4. Thu tế bào sau gây nhiễm
- Nuôi tế bào 37oC/ 5%CO2 trong vòng 48 - 72 giờ
- đông tan tế bào 3 lần ở tủ -20oC trước khi tiếp ựời.
* Do PCV2 không gây bệnh tắch tế bào, vì vậy không nhất thiết phải quan sát và ựánh giá CPE. Sau gây nhiễm 24 giờ, cần theo dõi và ựánh dấu những giếng bị tạp. 3.4.5.5. Kiểm tra kết quả phân lập
đối với PCV2, sau khi tiếp ựời khoảng 7 lần, cần khẳng ựịnh sự thắch nghi và nhân lên của virus (phân lập ựược hay không). Sau khi chắc chắn ựã phân lập ựược chủng virus, cần nhân lên trên chai T75 (dùng khoảng 2ml huyễn dịch virus/chai; nuôi trong vòng 4 ngày). đông tan tế bào 3 lần, chia ra các ống
eppendorf 1,5ml và bảo quản ở nhiệt ựộ -80oC. Trường hợp bảo quản tốt, có thể giữ
khoảng 6 tháng Ờ 12 tháng. Cần cấy chuyển giống sau khoảng 3 tháng bảo quản.
Ghi chú:
(1) để khẳng ựịnh sự nhân lên của virus trên môi trường tế bào, rất cần một số phương pháp như: miễn dịch huỳnh quang (IFA) hay PCR ...
(2) Cần thiết xác ựịnh môi trường tế bào dùng phân lập virus không tạp nhiễm những virus không gây CPE.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39