II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PC
3.4.3. Phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng PCV2
Sử dụng kỹ thuật blocking ELISA (SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking, Synbiotics) xác ựịnh dương tắnh huyết thanh học ựối với PCV2.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
3.4.3.1. Nguyên lý
Blocking ELISA dựa trên nguyên lý cạnh tranh vị trắ kết hợp với kháng nguyên. Trường hợp trong mẫu huyết thanh chẩn ựoán không có kháng thể ựặc hiệu kháng PCV2, kháng thể chuẩn kháng PCV2 gắn enzyme sẽ kết hợp ựược với kháng nguyên. Trường hợp trong mẫu huyết thanh chẩn ựoán có kháng thể ựặc hiệu, kháng thể này sẽ kết hợp với kháng nguyên PCV2 phủ ựĩa, do ựó một phần hoặc toàn bộ epitop sẽ bị khóa (blocking).
Kết quả dương tắnh: có kháng thể ựặc hiệu trong mẫu chẩn ựoán, phản ứng sẽ không chuyển màu khi thêm cơ chất.
Kết quả âm tắnh: không có kháng thể ựặc hiệu, phản ứng sẽ chuyển màu khi thêm cơ chất.
3.4.3.2. Các bước thực hiện Bảng 3.1. Sơ ựồ bố trắ thắ nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A đC (-) M5 M13 M21 M29 M37 M45 M53 M61 M69 M75 M83 B đC (-) M6 M14 M22 M30 M38 M46 M54 M62 M70 M76 M84 C đC (+) M7 M15 M23 M31 M39 M47 M55 M63 M71 M77 M85 D đC (+) M8 M16 M24 M32 M40 M48 M56 M64 M72 M78 M86 E M1 M9 M17 M25 M33 M41 M49 M57 M65 M73 M79 M87 F M2 M10 M18 M26 M34 M42 M50 M58 M66 M74 M80 M88 G M3 M11 M19 M27 M35 M43 M51 M59 M67 M73 M81 M89 H M4 M12 M20 M28 M36 M44 M52 M60 M68 M74 M82 M90
a. Pha loãng huyết thanh: huyết thanh chẩn ựoán ựược pha loãng 1/100 trong dung dịch pha loãng mẫu.
BƯỚC 1. Pha loãng huyết thanh 1/10 bằng dung dịch sample diluent
buffer trong ựĩa 96 giếng ựáy chữ U:
B1.1. Chia 90 ộl sample diluent buffer vào các giếng
B1.2. Cho 10ộl huyết thanh/ giếng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
BƯỚC 2. Pha loãng huyết thanh 1/100 bằng dung dịch sample diluent
buffer trong ựĩa phản ứng:
B2.1. Cho ựối chứng âm (-) vào giếng A1, B1: 100ul/giếng
B2.2. Cho ựối chứng dương (+) vào giếng C1, D1: 100ul/giếng
B2.3. Chia 90 ul sample diluent buffer vào các giếng làm phản ứng
B2.4. Cho 10ul huyết thanh ựã pha loãng 1/10 vào mỗi giếng
B2.5. Vỗ nhẹ ựĩa (mixing) ựể trộn ựều
B2.6. Dán ựĩa bằng tấm dán chuyên dụng
b. Ủ mẫu
Ủ ựĩa ở 37oC/60 phút (ổ 5 phút), tránh ánh sáng
Rửa 4 lần, 300ộl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
c. Cho kháng thể ựặc hiệu gắn enzyme
BƯỚC 1. Pha loãng conjugate
(kháng thể ựặc hiệu kháng PCV2 gắn enzyme)
B1.1. Tắnh toán lượng conjugate cần dùng
Lượng cần pha = (số giếng phản ứng + 4) x 100ul
B1.2. Pha conjugate 1/100
- Dùng một ống ly tâm 15ml mới ựể pha loãng
- Dùng piptte hút chắnh xác conjugate diluent buffer cần dùng
- Bỏ ựi một lượng conjugate diluent buffer bằng với lượng conjugate cần cho vào.
- đảo ựều (inverting) vài lần
- Giữ ống dung dịch ựã pha trong tối (tránh ánh sáng).
BƯỚC 2. Ủ conjugate và mẫu
B2.1. Cho vào các giếng phản ứng (kể cả ựối chứng âm và ựối chứng dương) conjugate ựã pha loãng: 100ul/giếng
B2.2. Vỗ nhẹ ựĩa ựể trộn ựều
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
B2.4. Rửa 4 lần, 300ộl/lần bằng dung dịch rửa (washing solution 1X)
d. Cho cơ chất/chất màu (Buffered peroxidase substrate)
Cho 100ộl cơ chất/ chất màu vào mỗi giếng để ở nhiệt ựộ phòng 20 phút
LƯU Ý: trong trường hợp ựối chứng âm chưa chuyển màu rõ, có thể ựể ựĩa phản ứng thêm khoảng 10 phút trong tủ ấm 37oC ựể tăng tốc ựộ phản ứng. Cần ựạy ựĩa ựể tránh bay hơi dung dịch phản ứng.
e. Dừng phản ứng
Thêm 50ul dung dịch H2SO4 2N ựể dừng phản ứng. Vỗ nhẹ ựĩa ựể trộn
ựều. đĩa phản ứng sau khi dừng phản ứng cần ựược ựo ngay giá trị OD.
f. đo giá trị OD, tắnh toán kết quả
Giá trị OD ựo ở bước sóng 450nm
Phản ứng ựược ựánh giá hợp cách nếu giá trị OD trung bình của ựối chứng âm >0,800, và giá trị OD trung bình của ựối chứng dương <0,500.
Tắnh giá trị S/N (OD giữa mẫu và ựối chứng âm). Các bước tắnh toán ựược thực hiện trên phần mềm Excel cung cấp bởi nhà sản xuất.
Nếu S/N ≤ 0,5, mẫu ựược coi dương tắnh huyết thanh học.
Ngược lại nếu S/N >0,5, mẫu ựược coi âm tắnh huyết thanh học.
3.4.3.3. Một số lưu ý
- để bộ kắt cân bằng ở nhiệt ựộ phòng (25oC) trước khi thực hiện phản
ứng. Những ựĩa ELISA không làm phản ứng cần ựược bảo quản ở 4oC.
- Các dung dịch cần ựược trộn ựều trước khi lấy ra thực hiện pha loãng - Không nhầm lẫn dung dịch pha loãng mẫu (sample diluent buffer) với dung dịch pha loãng conjugate (conjugate diluent buffer).
- Không dùng dung dịch rửa của những bộ kắt khác ựể rửa ựĩa - Dùng nước cất 3 lần ựể pha dung dịch của phản ứng.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35