II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PC
3.4.6. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang xác ựịnh PCV2 trong mô
tế bào
Sử dụng kit (JENO Biotech IncỜ Korea) có thành phần: 1X anti-PCV2 Monoclonal Antibody (8ml); 1X FITC Anti-Mouse Conjugate (8ml); 10X Washing Buffer (100ml); FA mounting fluid (3ml).
3.4.6.1. Các bước thực hiện
- Cố ựịnh tế bào sau gây nhiễm:
+ Loại bỏ hoàn toàn môi trường nuôi cấy trong giếng + Rửa bằng dung dịch PBS 3 lần, 200ul/giếng/lần + Loại bỏ hoàn toàn dung dịch PBS
+ Thêm 500ul cồn tuyệt ựối/giếng (trường hợp thể tắch ựĩa nhỏ hơn có thể ựiều chỉnh thể tắch nhưng cần ựảm bảo cồn ựược nhỏ ngập thảm tế bào)
+ Cố ựịnh ở -20oC trong vòng 2 giờ (hoặc có thể ựể qua ựêm)
+ Loại bỏ hoàn toàn cồn - Hydrat hóa tế bào
+ Nhỏ 500ul PBS (ngập thảm tế bào) + Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong 2 tiếng - Ủ kháng thể ựặc hiệu
+ Nhỏ ngập thảm tế bào kháng thể ựơn dòng kháng PCV2 (1X anti-PCV2
mAb). Ủ ở 37oC/60 phút
- Rửa ựĩa:
+ Chuẩn bị dung dịch rửa 1X từ 10X washing solution bằng cách pha 1 thể tắch 10X washing solution vào 9 thể tắch nước cất 3 lần (ựã hấp).
i) Cho 500ul dung dịch rửa 1X/giếng
ii) để dung dịch rửa trong giếng trong vòng 3 phút iii) Loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa
+ Lặp lại 2 lần từ bước i ựến bước iii - Ủ kháng kháng thể
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
+ Nhỏ ngập thảm tế bào kháng kháng thể gắn huỳnh quang (1X FITC anti-mouse conjugate)
+ Ủ 37oC/60 phút
+ Rửa ựĩa: thực hiện như trên + Làm khô hoàn toàn ựĩa
(Chú ý: cần bảo quản ựĩa tránh ánh sáng)
3.4.6.2. đọc kết quả
- Khi quan sát, cần có ựối chứng âm ựể ựối chiếu
- Quan sát tế bào bằng vật kắnh thông thường ựể nhìn thấy rõ ảnh tế bào, sau ựó mới chuyển sang chế ựộ UV ựể quan sát tắn hiệu huỳnh quang.
Cần chú ý: do PCV2 nhân lên trong nhân tế bào, vì vậy chỉ khi thấy tắn hiệu huỳnh quang ở nhân tế bào mới coi là ựặc hiệu.
- Trường hợp làm phản ứng trên phiến kắnh (hoặc cover slip), có thể nhỏ FA mounting fluid (có tác dụng giống như dầu soi kắnh), có thể quan sát ở vật kắnh có ựộ phóng ựại lớn hơn.