3.6.1. So sỏnh đặc điểm lõm sàng tại cỏc thời điểm T0, T1 và T2
Biểu đồ 3.13. So sỏnh cỏc đặc điểm lõm sàng tại cỏc thời điểm T0, T1 và T2
(ghi chỳ: p1: so sỏnh T0 với T1, p2 so sỏnh T0 và T2. *p ≤ 0,001: rất cú ý nghĩa thống kờ. Phộp kiểm Wilcoxon)
Nhận xột:
+ Sau 12 tuần điều trị VQR bằng phương phỏp khụng phẫu thuật kết hợp với khỏng sinh toàn thõn, cỏc triệu chứng lõm sàng về chỉ số mảng bỏm răng (PLI), chỉ số lợi (GI), độ sõu tỳi quanh răng (PPD), mất bỏm dớnh lõm sàng (CAL) giảm khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ.
3.6.2. So sỏnh số lượng vi khuẩn tại cỏc thời điểm T0, T1 và T2
Bảng 3.12. So sỏnh số lượng vi khuẩn tại cỏc thời điểm T0, T1 và T2
Đặc điểm lõm sàng X ± SD p1 p2 T0 T1 T2 Số lượng Aa ở dịch lợi (Ct) 20,29±3,31 26,65±4,04 26,45 ± 3,26 0,000* 0,000* Tỷ lệ Aa ở dịch lợi 0,67 ± 0,13 0,62 ± 0,21 0,49 ± 0,31 0,432 0,000* Số lượng Pg ở dịch lợi (Ct) 20,35 ±3,94 25,78 ±4,08 24,80 ± 4,67 0,000* 0,000* Tỷ lệ Pg ở dịch lợi 0,68 ± 0,18 0,67± 0,19 0,61 ± 0,15 0,83 0,000*
p1: so sỏnh T0 với T1, p2 so sỏnh T0 và T2. *p ≤ 0,001: rất cú ý nghĩa thống kờ. Phộp kiểm Wilcoxon
Nhận xột:
+ So sỏnh số lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitans cỏc thời điểm
T0 và T1 T0và T2 khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ p = 0,000, nhưng tỷ lệ vi khuẩn này so với hệ vi khuẩn trong miệng tại thời điểm T0 và T1 cú khỏc biệt 0,04 ± 0,08 với p = 0,432 khụng cú ý nghĩa thống kờ; tại T0 và T2 khỏc biệt 0,18 ± 0,18 với p = 0,000 rất cú ý nghĩa thống kờ.
+ So sỏnh số lượng vi khuẩn P. gingivalis tại thời điểm T0 - T1 và T0 - T2 khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ p = 0,000.
+ Tỷ lệ vi khuẩn P. gingivalis so với hệ vi khuẩn trong miệng tại thời điểm T0 và T1 cú khỏc biệt 0,01 ± 0,01 với p = 0,83 khụng cú ý nghĩa thống kờ; tại T0 và T2 khỏc biệt 0,07 ± 0,03 với p = 0,000 rất cú ý nghĩa thống kờ.
Hỡnh 3.14. Kết quả định lượng Aa trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhõn mó số 02 ở cỏc thời điểm T0 (A), T1(B), T2(C).
Nhận xột:
+ Kết quả realtime PCR định lượng A. actinomycetemcomitans trong
mẫu bệnh phẩm của bệnh nhõn mó số 02 ở cỏc thời điểm T0 (A): 18,5 Ct, T1(B): 25 Ct, T2(C): õm tớnh.
Hỡnh 3.15. Kết quả định lượng Pg trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhõn mó số 02 ở cỏc thời điểm T0 (A), T1(B), T2(C).
Nhận xột:
+ Kết quả realtime PCR định lượng P. gingivalis trong mẫu bệnh phẩm
của bệnh nhõn mó số 02 ở cỏc thời điểm T0 (A): 28 Ct, T1(B): õm tớnh, T2(C): õm tớnh.
Chương 4 BÀN LUẬN
4.1. ĐẶC ĐIỂM VỀ TUỔI VÀ GIỚI TÍNH CỦA ĐỐI TƯỢNG
NGHIấN CỨU
Viờm quanh răng mạn tớnh là một bệnh hay gặp ở trờn thế giới cũng như Việt Nam. Bệnh diễn tiến từ từ, phỏ hủy mụ quanh răng và tiờu xương ổ răng tạo thành tỳi quanh răng hay tụt lợi hoặc cả hai [1].
Theo điều tra của Viện Dinh dưỡng quốc gia Mỹ về sức khỏe răng miệng năm 2009ữ2010 [2], cú 4,7% bị viờm quanh răng với cỏc mức độ khỏc nhau trờn 64,7 triệu dõn ở độ tuổi trờn 30; trong đú VQR mức độ nhẹ là 8,7%, VQR mức độ trung bỡnh là 30% và VQR mức độ nặng là 8,5%.
Điều tra của WHO tại Ultal Pradesh (Ấn Độ) năm 2000 cho thấy tỷ lệ bệnh VQR độ tuổi 35ữ44 chiếm 89,6%, độ tuổi 65ữ74 chiếm 79.9% [3]. Độ tuổi trung bỡnh bị viờm quanh răng món tớnh tại Chile năm 2005 trong nghiờn cứu của Marta Gajardo và cộng sự là 47 ± 7,29 [64].
Ở Việt Nam, theo điều tra của Nguyễn Cẩn và cộng sự (1998) tại cỏc tỉnh thành phớa Nam và TP.HCM, 1/3 dõn số trờn 30 tuổi bị VQR [64]. Điều tra sức khỏe về cỏc bệnh trong miệng của Trần Văn Trường và cộng sự năm 2000 khụng thấy cú sự khỏc biệt về tỷ lệ mắc bệnh VQR giữa nam và nữ (36,5% nam, 27,5% nữ) với p>0,05 [4].
70 bệnh nhõn trong nhúm nghiờn cứu của chỳng tụi cú độ tuổi 29 ữ 60, bao gồm nam giới = 44 người (62,9%) với tuổi trung bỡnh 45,14 ± 8,78, nữ giới = 26 người (37,1%) cú tuổi trung bỡnh 42,81 ± 8,51, phự hợp với lứa tuổi bị bệnh VQR mạn tớnh theo phõn loại của Hiệp hội Nha chu thế giới (AAP)
[1], với nghiờn cứu của Marta Gajardo (2005) [64] và cỏc nghiờn cứu về bệnh này trong nước của Nguyễn Cẩn (1994) [65], Trần Văn Trường (2000) [4]. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi nhận thấy tỷ lệ mắc bệnh của nam nhiều hơn nữ nhưng độ tuổi mắc bệnh tương đương. Như vậy, bệnh VQR là một bệnh lý phổ biến tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh trong nghiờn cứu này cao hơn so với điều tra của Trần Văn Trường hay Nguyễn Cẩn vỡ bệnh nhõn tham gia nghiờn cứu được lựa chọn tại khoa Nha chu của Bv. Răng Hàm Mặt TP.Hồ Chớ Minh, do đú số bệnh nhõn tập trung điều trị nhiều hơn. Những nghiờn cứu dọc ở trong nước về nguyờn nhõn gõy bệnh, theo dừi và điều trị bệnh trong thời gian dài cũng khụng nhiều.
4.2. BIẾN SỐ NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH CÁC BIẾN SỐ NGHIấN CỨU
Hiện nay, việc chẩn đoỏn, phõn loại và điều trị bệnh VQR vẫn dựa chủ yếu trờn cỏc triệu chứng lõm sàng và X quang. Cỏc chỉ số lõm sàng về mảng bỏm răng, chỉ số lợi, răng lung lay, độ sõu tỳi quanh răng, mất bỏm dớnh lõm sàng và hỡnh ảnh X quang là cơ sở để chẩn đoỏn và tiờn lượng bệnh ở mức nặng, nhẹ hay trung bỡnh; nhưng khụng giỳp đỏnh giỏ được vi khuẩn gõy bệnh, sự tăng hay giảm của vi khuẩn gõy bệnh VQR, do đú xột nghiệm vi khuẩn gõy bệnh trước, trong và sau điều trị sẽ giỳp bỏc sĩ lõm sàng đỏnh giỏ được phương phỏp điều trị cú hiệu quả hay khụng về mặt lõm sàng, cận lõm sàng [11],[49].
Cỏc chỉ số lõm sàng được dựng để chẩn đoỏn xỏc định, đỏnh giỏ mức độ viờm quanh răng là chỉ số lợi (GI), chỉ số mảng bỏm (PLI), độ sõu tỳi (PPD), độ mất bỏm dớnh lõm sàng (CAL) và răng lung lay. Đõy là những chỉ số thụng dụng được ỏp dụng trong cỏc nghiờn cứu về bệnh VQR cũng như trong thực hành lõm sàng trờn thế giới và ở Việt Nam [1],[3],[7]. Trờn thực tế, việc khỏm
lõm sàng và xỏc định cỏc chỉ số trờn rất đũi hỏi người bỏc sỹ phải rất tỷ mỉ và kiờn nhẫn và phải được tập huấn, định chuẩn về chỉ số Kappa [11]. Việc đo độ sõu tỳi và mất bỏm dớnh lõm sàng là một phương phỏp khỏm quan trọng - “tiờu chuẩn vàng” trong khỏm lõm sàng, đỏnh giỏ mức độ phỏ hủy mụ quanh răng và tiờu xương ổ răng [8],[11]. Bỡnh thường đo tỳi quanh răng dễ và nhanh, đụi khi cũng khú phõn biệt giữa tỳi quanh răng nụng và khe lợi [11].
Đo mất bỏm dớnh lõm sàng (CAL) chớnh xỏc khú hơn, nhưng CAL phản ỏnh toàn bộ mức độ tổn thương của mụ quanh răng tốt hơn độ sõu tỳi [8]. Theo Hiệp hội Nha chu Mỹ, đo CAL là một phương phỏp khỏm lõm sàng cú giỏ trị nhất trong việc đỏnh giỏ kết quả điều trị [1]. Chỳng tụi sử dụng cõy đo tỳi của Miller, cú độ chia vạch 1mm để đo độ sõu tỳi quanh răng, mất bỏm dớnh lõm sàng tương tự như nghiờn cứu của Jerry J. Garnick (2000) [63], Paul M (2005) [8].
VQR là một bệnh nhiễm khuẩn do nhiều loài vi khuẩn gõy ra, chủ yếu là cỏc vi khuẩn kỵ khớ Gram (-). Tuy nhiờn, loại vi khuẩn và tỷ lệ, mức độ gõy bệnh của vi khuẩn cú thể khỏc nhau tựy theo mỗi vựng địa lý [3],[28],[29]. Do vậy, khụng hẳn hợp lý nếu sử dụng cỏc kết quả nghiờn cứu về vi khuẩn trong VQR của cỏc tỏc giả nước ngoài để ỏp dụng trong điều trị VQR ở trong nước. Việc xỏc định và định lượng vi khuẩn gõy bệnh hiện nay khụng cũn là vấn đề khú khăn.
Ở Hà Nội, nghiờn cứu của Nguyễn Vũ Trung (1998) nuụi cấy vi khuẩn trong 100 mẫu bệnh phẩm dịch khe lợi ở người lành và 100 mẫu bệnh phẩm dịch khe lợi ở người bị VQR cú tỳi sõu từ 2 mm trở lờn; kết quả cho thấy cỏc vi khuẩn rất khú nuụi cấy và phõn lập, tỷ lệ A. actinomycetemcomitans là 4% ở nhúm bệnh và 0% ở nhúm lành, tỷ lệ P. gingivalis là 9% ở nhúm bệnh và
nhiễm khuẩn do răng của Nguyễn Đức Tuấn (2010) cho thấy kết quả cấy khuẩn của 9 trường hợp ỏp xe quanh răng phỏt hiện vi khuẩn kỵ khớ P. gingivalis trong 1 trường hợp và đơn khuẩn hiếu khớ trong 8 trường hợp cũn
lại [67]. Tại TP.Cần Thơ, theo nghiờn cứu nhiễm khuẩn do răng của Trầm Kim Định (2010), cấy khuẩn trong 7 trường hợp ỏp xe nha chu cho kết quả: 1 trường hợp cú vi khuẩn kỵ khớ Prevotella,1 trường hợp đa khuẩn hiếu khớ - kị khớ S. viridans và Peptostreptococcus và khụng tỡm thấy P. gingivalis [68].
Trong cỏc phương phỏp phỏt hiện vi khuẩn, kỹ thuật PCR và realtime PCR nhạy nhất [21],[24]. Yoshida và c.s. (2003) nhận định kỹ thuật realtime PCR nhạy hơn kỹ thuật PCR đơn thuần khi khảo sỏt phỏt hiện P. gingivalis và
A. actinomycetemcomitans trong nước bọt của 7 bệnh nhõn VQR; kết quả
PCR khụng phỏt hiện được 1 trường hợp cú tỷ lệ % P. gingivalis thấp nhất
[69]. Boutaga (2003) xỏc định realtime PCR phỏt hiện A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis với độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 94%
[70]. Verner và c.s. (2006) nhận định realtime PCR nhạy hơn phương phỏp nuụi cấy. Tỷ lệ vi khuẩn phỏt hiện bằng kỹ thuật realtime PCR cao hơn phương phỏp nuụi cấy, mức độ chờnh lệch tỷ lệ phỏt hiện vi khuẩn giữa realtime PCR và nuụi cấy cao nhất là 51,4% đối với P. gingivalis, 36,1% đối với T. forsythensis, 12,5% đối với F. nucleatum, 8,3% đối với P. intermedia, 3% đối với A. actinomycetemcomitans [62]. Trong một phõn tớch tổng hợp 5 nghiờn cứu, Atieh và c.s. (2008) kết luận realtime PCR cú độ chớnh xỏc cao hơn phương phỏp nuụi cấy [71].
Realtime PCR là phương phỏp cực nhạy, đặc hiệu, cú thể phỏt hiện được vi khuẩn cho dự số lượng DNA rất ớt (dưới 10 vi khuẩn trờn một mẫu bệnh phẩm) [24], mặc dự vi khuẩn khụng cũn sống hoặc vi khuẩn kỵ khớ khú nuụi cấy hoặc bệnh nhõn đó sử dụng khỏng sinh trước khi làm xột nghiệm.
Hơn nữa, realtime PCR đơn giản hơn, cho kết quả nhanh hơn. Thời gian thực hiện chỉ trong vài giờ, trong khi phương phỏp nuụi cấy đũi hỏi nhiều ngày cú kết quả. Giỏ thành xột nghiệm PCR và realtime PCR thấp hơn phương phỏp nuụi cấy đối với vi khuẩn kỵ khớ. Realtime PCR cú khả năng phõn biệt được những chủng rất độc hay ớt độc trong cựng một loài vi khuẩn.
Đặc biệt, realtime PCR giỳp định lượng (tuyệt đối và tương đối) số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm. Để hiểu rừ bệnh căn vi khuẩn của VQR, việc định lượng vi khuẩn là cần thiết [8],[11],[54]. Ứng dụng quan trọng của kết quả xột nghiệm realtime PCR trong lõm sàng khụng chỉ là chẩn đoỏn căn nguyờn gõy VQR mà cũn giỳp ớch rất nhiều cho bỏc sĩ lõm sàng đỏnh giỏ hiệu quả điều trị, điều chỉnh phỏc đồ điều trị kịp thời và theo dừi sự tiến triển của bệnh. Bởi vậy, chỳng tụi đó sử dụng kỹ thuật realtime PCR định lượng A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis.
Khi thực hiện realtime PCR, cần xỏc định nồng độ tối ưu của mồi xuụi, mồi ngược của gen lkt (A. actinomycetemcomitans), gen fimA (P. gingivalis),
gen 16S rDNA (hệ vi khuẩn trong miệng) và mẫu dũ Taqman để thu được trị số chu kỳ ngưỡng Ct thấp nhất 102, do vậy hiệu quả khuếch đại cao nhất. Cặp mồi khuếch đại gen lkt (A. actinomycetemcomitans), gen fimA (P. gingivalis)
cú độ nhậy cao 100%. Cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA - đặc hiệu cho cỏc vi khuẩn trong miệng để tớnh tỷ lệ A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis
nhằm tỡm thấy sự khỏc biệt rất cú ý nghĩa về số lượng và tỷ lệ A. actinomycetemcomitans với P. gingivalis trong VQR mạn tớnh (p < 0,001).
Định lượng vi khuẩn bằng realtime PCR là định lượng tuyệt đối hoặc tương đối. Định lượng tuyệt đối cho biết số vi khuẩn đớch hiện diện trong mẫu, bằng cỏch so sỏnh lượng acid nucleic đớch chưa biết trong bệnh phẩm với cỏc mẫu chuẩn đó biết rừ số lượng acid nucleic [59],[60]. Định lượng này
đũi hỏi việc thu thập mẫu bệnh phẩm phải thật chớnh xỏc, phải biết rừ thể tớch hay trọng lượng mẫu thử. Định lượng tương đối xỏc định số lượng tương đối hoặc tỷ lệ vi khuẩn đớch, bằng phương phỏp so sỏnh chu kỳ ngưỡng theo phương phỏp ∆∆Ct.
N = 2∆∆Ct = 2(∆Ct đớch – ∆Ct 16S rDNA)
Trong đú ∆∆Ct bằng ∆Ct của vi khuẩn đớch trừ ∆Ct 16S rDNA. ∆Ct là sự khỏc biệt chu kỳ ngưỡng giữa vi khuẩn đớch và hệ vi khuẩn.
Theo Yoshida (2003), phương phỏp tớnh đơn giản này chớnh xỏc và giỳp xỏc định tương đối vi khuẩn gõy bệnh nha chu [68].
Realtime PCR cho phộp định lượng từng loài vi khuẩn và tổng số tế bào vi khuẩn dựa theo một mẫu chứng đặc hiệu đó biết số lượng. Tuy nhiờn, số lượng chớnh xỏc 16S DNA trong mỗi tế bào của nhiều loài vi khuẩn vựng
miệng cũn chưa biết rừ, thời gian nhõn đụi của cỏc loài vi khuẩn khỏc nhau. Đõy là trở ngại lớn trong việc định lượng tuyệt đối số lượng vi khuẩn bằng realtime PCR dựa trờn trỡnh tự gen 16S rDNA. Núi chung, đỏnh giỏ tuyệt đối số lượng vi khuẩn phức tạp do tổng số vi khuẩn tựy thuộc vào phương phỏp lấy mẫu, số mẫu được lấy trờn một bệnh nhõn, vị trớ lấy mẫu, phương phỏp dựng để đếm số lượng dựa trờn thể tớch bệnh phẩm và sự pha loóng bệnh phẩm [11].
Trờn phương diện lõm sàng, phõn tớch tỷ lệ vi khuẩn trong hệ vi khuẩn thường cần thiết để đỏnh giỏ kết quả điều trị. Lyons và cs.[21] nờu lờn tầm quan trọng của định lượng tương đối hơn là xỏc định số lượng tuyệt đối của một loài vi khuẩn riờng biệt trong một mẫu bệnh phẩm đa khuẩn. Nhiều nghiờn cứu realtime PCR định lượng tương đối A. actinomycetemcomitans, P.
gingivalis trong VQR như của Lyons (2000) [21], Yoshida (2003) [69], Maeda (2003) [72], Lau (2004) [73], Boutaga (2007) [70].
Định lượng tương đối đơn giản hơn mà vẫn cú giỏ trị đối với lõm sàng. Do vậy, chỳng tụi ỏp dụng realtime PCR định lượng tương đối A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis trong nghiờn cứu.
Realtime PCR sử dụng cỏc đoạn mồi đặc hiệu loài vi khuẩn, trong đú bộ mồi 16S rDNA phổ biến nhất trong nha chu. Mồi 16S rDNA đặc hiệu cỏc loài vi khuẩn ở miệng do hầu hết cỏc vi khuẩn ở miệng đều cú gen được bảo tồn cao này. Gen 16S rDNA mó húa cho tiểu đơn vị 16S RNA của ribụsụm [21]. Do đú, để xỏc định tỷ lệ A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis trong tổng
số lượng cỏc vi khuẩn, chỳng tụi sử dụng bộ mồi phổ thụng này để khuếch đại hiệu quả DNA của cỏc vi khuẩn trong bệnh phẩm.
Cỏc kết quả dương tớnh giả của realtime PCR cú thể xảy ra. Cỏc loài cú phả hệ gần nhau cú thể cú gen 16S rDNA khỏc nhau chỉ vài nucleotid và cú
thể khụng phõn biệt được qua PCR gen 16S rDNA [41]. Cũng vậy, cỏc điều
kiện realtime PCR (nhiệt độ bắt cặp, nồng độ magnesium) rất quan trọng để trỏnh phản ứng chộo [59],[60]. Do realtime PCR quỏ nhạy nờn sự lõy nhiễm giữa cỏc mẫu sẽ dẫn đến dương tớnh giả.
Kết quả õm tớnh giả cú thể từ những thất bại của realtime PCR do cú chất ức chế phản ứng realtime PCR trong DNA bệnh phẩm, do chưa biết rừ hoàn toàn về tớnh dị hợp tử của cỏc gen đớch. Thiết kế đoạn mồi phải đảm bảo trỡnh tự nucleotid giống hoàn toàn trỡnh tự chuỗi đớch muốn khuếch đại vỡ đõy là yếu tố quyết định độ nhạy tối đa. Tuy nhiờn, khụng phải tất cả cỏc chủng A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis cú trỡnh tự gen đớch giống nhau 100%
[8],[73],[74]. Vỡ thế, khụng phải tất cả chủng của một loài vi khuẩn sẽ là đớch để mồi phỏt hiện.
Để kiểm chứng dương tớnh giả và õm tớnh giả nhằm đảm bảo sự chớnh xỏc của kết quả realtime PCR, mỗi xột nghiệm realtime PCR luụn luụn kốm
theo chứng õm tớnh (-) kiểm tra sự lõy nhiễm, chứng dương tớnh (+) kiểm tra độ nhạy của dung dịch PCR mix, chứng 16 SrDNA dương tớnh(+) kiểm tra độ nhạy của PCR mix và kiểm tra sự ly trớch DNA.
Đoạn mồi quyết định sự đặc hiệu của realtime PCR, cú thể ảnh hưởng đến khả năng dương tớnh giả và õm tớnh giả. Cỏc mẫu dũ oligonucleotid cú khả năng phõn biệt những loài gần nhau cú những chuỗi tương đồng, trong khi mẫu dũ toàn bộ bộ gen của vi khuẩn khụng thể phõn biệt được. Do vậy, để phỏt hiện A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, chỳng tụi chọn cặp mồi và