2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu
- Thử nghiệm lõm sàng, đỏnh giỏ kết quả trước – sau điều trị. Bệnh nhõn VQR mạn tớnh dạng toàn thể thỏa món cỏc tiờu chuẩn chọn mẫu, được lấy mẫu bệnh phẩm (dịch khe lợi) vào cỏc thời điểm: Ngày đầu tiờn, Sau 02 tuần và sau 12 tuần.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiờn cứu
Nghiờn cứu của chỳng tụi được thiết kế thực nghiệm lõm sàng trờn một nhúm bệnh nhõn và đỏnh giỏ kết quả trước - sau điều trị, cỏch tớnh cỡ mẫu:
N = Z21-α/2 P(1-P)/d2 với độ chớnh xỏc d=10%, độ tin cậy 95%, P là tỷ lệ điều trị đạt kết quả theo tiờu chuẩn hết VQR khoảng 80%, α=0,05, Z2
1-α/2
=1,962, cỡ mẫu tối thiểu là 62 bệnh nhõn. Để tăng độ chớnh xỏc và giảm sai lầm do kỹ thuật, mẫu chớnh thức là 70 bệnh nhõn [63],[69],[94]. 70 bệnh nhõn VQR mạn tớnh dạng toàn thể thỏa món cỏc tiờu chuẩn chọn mẫu, bệnh phẩm gồm 210 mẫu dịch khe lợi (70 bệnh nhõn VQR x 3 lần lấy mẫu). Tiến hành chọn mẫu tớch lũy theo thời gian đến khi đủ cỡ mẫu nghiờn cứu.
2.2.3. Cỏc bước tiến hành nghiờn cứu
Ngày đầu tiờn (Thời điờ̉m T0):
(1) Khỏm, đỏnh giỏ cỏc chỉ số lõm sàng: -Viờm lợi (GI)
-Độ mất bỏm dớnh lõm sàng (CAL) -Răng lung lay
-Đỏnh giỏ mức độ và dạng tiờu xương ổ răng: chụp phim toàn cảnh kỹ thuật số (Panorex).
(2) Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 1.
(3) Hướng dẫn bệnh nhõn cỏch vệ sinh răng miệng: chải răng theo kỹ thuật Bass cải tiến, sử dụng chải mềm và kem đỏnh Colgate Total. Đưa cho bệnh nhõn tờ rơi nhắc nhở về cỏch chải răng (Phụ lục).
Sau 1 tuần: khi cú kết quả realtime PCR
- Điều trị theo phỏc đồ cho bệnh nhõn. - Hẹn bệnh nhõn tỏi khỏm sau 1 tuần. Sau 2 tuần (Thời điờ̉m T1):
- Bệnh nhõn tỏi khỏm, đỏnh giỏ cỏc chỉ số lõm sàng, duy trỡ cỏc phương phỏp hỗ trợ cơ học.
- Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn
A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 2.
- Hẹn bệnh nhõn tỏi khỏm sau 04 tuần, 08 tuần, 12 tuần (mốc hẹn bệnh nhõn là thời điểm T0).
Sau 12 tuần (Thời điờ̉m T2):
- Bệnh nhõn tỏi khỏm, đo cỏc chỉ số trờn lõm sàng, chụp phim toàn cảnh. - Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn
A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 3.
2.2.4. Phương phỏp thu thập dữ liệu lõm sàng
2.2.4.1. Tiờu chuẩn chẩn đoỏn VQR món tớnh dạng toàn thờ̉ [1], [8]
-Tỳi quanh răng ≥ 3mm, đang hoạt động (chảy mỏu khi thăm dũ) -Răng lung lay độ I - III
-Giảm chiều cao của mào xương ổ răng: 3 mm < mào xương ổ răng (trờn phim Panorex kỹ thuật số).
-Khi tổn thương hiện diện > 30% cỏc răng trờn cung hàm.
2.2.4.2. Tiờu chuẩn xỏc định hờ́t VQR món tớnhdạng toàn thờ̉
Để đỏnh giỏ kết quả sau điều trị, chỳng tụi dựa vào cỏc tiờu chớ sau: -Tỡnh trạng lợi viờm: chỉ số GI và chỉ số PLI
-Độ sõu tỳi lợi (PPD).
-Tỡnh trạng xương ổ răng sau điều trị.
-Kết quả xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn
A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis õm tớnh hoặc cú số lượng rất ớt
(chuẩn định lượng õm tớnh hoặc < 100 copy/mẫu).
Đỏnh giỏ kết quả sau điều trị được chia làm 3 mức độ: tốt, khỏ, trung bỡnh.
Đỏnh giỏ kờ́t quả sau 2 tuần (Thời điờ̉m T1):
- Mức độ tốt: lợi hết viờm, màu hồng, săn, khụng chảy mỏu khi thăm khỏm, răng sạch khụng cú mảng bỏm răng:
* Chỉ số GI: 0 - 0,1 * Chỉ số PLI: 0 - 0,1.
- Mức độ khỏ:
Lợi viờm nhẹ, màu hồng nhạt, chảy mỏu khi thăm khỏm, cú rất ớt mảng bỏm răng.
* Chỉ số GI: 0,1 - 0,9 * Chỉ số PLI: 0,1 - 0,9.
- Mức độ trung bỡnh:
Tỡnh trạng lợi khụng được cải thiện. * Chỉ số GI ≥ 1.
Đỏnh giỏ kờ́t quả điều trị sau 12 tuần: - Mức độ tốt:
+ Lợi bỡnh thường, khụng viờm chải răng khụng chảy mỏu, răng sạch khụng cú mảng bỏm răng: GI: 0-0,1; PLI: 0-0,1.
+ Xương ổ răng giữ nguyờn mức tiờu xương.
- Mức độ khỏ:
+ Lợi khụng viờm, chải răng khụng chảy mỏu cú rất ớt mảng bỏm răng: GI: 0,1-0,9; PLI: 0,1-0,9.
+ Độ sõu tỳi lợi giảm cũn 2/5 - < 3/5 so với trước khi điều trị. + Xương ổ răng tiờu thờm dưới 20%.
- Mức độ trung bỡnh:
+ Tỡnh trạng lợi khụng được cải thiện. + Tỳi quanh răng như cũ hoặc sõu hơn. + Xương ổ răng tiờu thờm trờn 20%. Cỏc chỉ số lõm sàng
♦ Chỉ số mảng bỏm (Plaque Index - PLI): là chỉ số đỏnh giỏ độ dày của
mảng bỏm trờn mặt răng theo Silness và Lửe (1964) [1],[11].
- Cỏch đỏnh giỏ: mặt răng chia thành 4 vựng gồm mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần và mặt trong. Thổi khụ cỏc răng trước khi đỏnh giỏ chỉ số mảng bỏm.
- Đọc kết quả:
Bảng 2.1. Tiờu chuẩn chỉ số mảng bỏm [1],[11] Điểm số Tiờu chuẩn chỉ số mảng bỏm (PLI)
0 Khụng cú mảng bỏm.
1 Mảng bỏm khụng thấy được bằng mắt thường, nhưng thấy được khi dựng cõy đo tỳi cạo trờn bề mặt răng từ khe lợi.
2 Mảng bỏm mỏng hay trung bỡnh, phủ mặt răng, thấy bằng mắt thường.
3 Mảng bỏm dày, mảnh vụn thức ăn nhiều trong tỳi lợi.
Cho điểm số từ 0 đến 3 ở 4 vựng của một răng theo bảng 2.1. Điểm PLI trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng điểm PLI của 4 vựng răng chia cho 4.
- Ngưỡng đỏnh giỏ: Rất tốt (sạch): 0 điểm Tốt: 0,1 ữ 0,9 điểm Trung bỡnh: 1 ữ 1,9 điểm Kộm: 2,0 ữ 3,0 điểm
♦ Chỉ số lợi (Gingival Index - GI)
- Mục đớch: Đỏnh giỏ mức độ viờm lợi theo chỉ số GI của Silness & Lửe (1967).
Bảng 2.2.Tiờu chuẩn chỉ số lợi [1],[11]
Điểm số Tiờu chuẩn chỉ số lợi (GI)
0 Lợi bỡnh thường
1 Lợi đổi màu, khụng chảy mỏu khi thăm dũ 2 Lợi sưng, đỏ, chảy mỏu khi thăm dũ
3 Lợi sưng đỏ, lở loột, dễ chảy mỏu tự phỏt
• Cỏch đỏnh giỏ: Khỏm mụ lợi ở 4 vựng: rónh lợi ngoài gần, giữa, xa và mặt trong. Khụng đỏnh giỏ ở răng 8.
• Đọc kết quả: Cho điểm số từ 0 đến 3 theo bảng 2. Điểm GI trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng điểm GI bốn vựng răng chia cho 4.
Ngưỡng đỏnh giỏ:
Rất tốt (lợi lành mạnh) : 0
Tốt : 0,1 - 0,9 Trung bỡnh : 1,0 - 1,9 Kộm ( nặng) : 2,0 - 3,0
♦ Độ sõu tỳi (Periodontal probing depth - PPD)
• Định nghĩa: PPD là khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến bờ lợi tự do [1],[11]. • Cỏch đỏnh giỏ:
-Đo độ sõu của tỳi quanh răng bằng cõy đo tỳi của William (Hỡnh 2.1) [62].
-Đo khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến bờ lợi tự do tại 4 vị trớ trờn mỗi răng: mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần, mặt trong.
-Cỏch đo tỳi: Đặt cõy đo tỳi William cú chia vạch millimet tại 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 và 10 mm; với ỏp lực nhẹ nhàng vào khe lợi sao cho song song với trục dọc của răng. Di chuyển cõy đo tỳi dọc theo chu vi mỗi mặt răng, ghi nhận độ sõu tỳi tại bốn vị trớ.
• Đọc kết quả:
- Độ sõu tỳi được đọc ở mức vạch trờn cõy đo tỳi ngang mức đỉnh bờ lợi tự do.
- Độ sõu tỳi trung bỡnh của mỗi răng bằng tổng số độ sõu tỳi của bốn vị trớ quanh răng chia cho 4.
♦ Mất bỏm dớnh lõm sàng (Clinical attachment loss - CAL)
• Định nghĩa: mất bỏm dớnh lõm sàng là khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến đường nối men-xờ măng [1],[11].
• Cỏch đỏnh giỏ: Đặt cõy đo tỳi đo từ đỏy tỳi đến đường nối men-xờ măng của răng tại 4 vị trớ trờn mỗi răng: mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần, mặt trong.
• Đọc kết quả:
-CAL được đọc ở mức vạch trờn cõy đo tỳi tại đường nối men-xờ măng.
-CAL trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng CAL tại 4 vị trớ quanh răng chia cho 4.
Hỡnh 2.1. Cõy đo túi William ♦ Độ lung lay của răng
Đỏnh giỏ mức độ lung lay răng theo Miller được ghi nhận theo bảng 2.3. [1],[11].
Bảng 2.3. Mức độ lung lay của răng
Độ Mức độ lung lay của răng
0 Răng khụng lung lay
1 Cảm giỏc răng lung lay
2 Răng lung lay nhỡn thấy theo chiều ngoài - trong
3
Răng lung lay nhỡn thấy theo cỏc chiều (ngoài - trong, gần-xa và theo trục răng).
2.2.5. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
- Cỏc vật liệu (gũn cuộn, cụn giấy số 30) và dụng cụ đều được khử khuẩn. - Lấy bệnh phẩm dịch lợi ở tỳi quanh răng cú chảy mỏu khi thăm khỏm và sõu nhất trong cỏc tỳi khi thăm dũ vào ngày đầu tiờn trong nghiờn cứu.
- Cỏch lấy bệnh phẩm dịch lợi: cỏch ly nước bọt với vựng răng lấy mẫu bằng gũn cuộn. Sau khi lau sạch mảng bỏm trờn lợi và thổi nhẹ cho khụ, đưa 5 cõy cụn giấy số 30 và dài 21 mm vụ trựng vào đến đỏy tỳi (thao tỏc nhẹ, trỏnh chảy mỏu), để trong 10 giõy, lấy cụn giấy ra và cho vào lọ effendorf cú nắp đậy (Hỡnh 2.2). Một bệnh nhõn được lấy mẫu 03 lần, tại cỏc thời điểm T0, T1, T2 tại cựng một vị trớ (lưu hỡnh chụp trong bệnh ỏn).
Mỗi vị trớ lấy mẫu bệnh phẩm sử dụng một bộ dụng cụ riờng để trỏnh sự lõy nhiễm chộo. Mẫu vi khuẩn A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis
được lấy trờn bệnh nhõn VQR tại khoa Nha chu của Bệnh viện Răng Hàm Mặt tp.Hồ Chớ Minh, sau đú được tỏch triết DNA và bảo quản ở tủ lạnh sõu (nhiệt độ -800C - tủ chuyờn biệt SANYO) tại khoa xột nghiệm của bệnh viện cho đến khi thực hiện phõn tớch tại Trung tõm nghiờn cứu Gen-Protein của trường Đại học Y Hà Nội (khi gửi mẫu ra Hà Nội theo đường hàng khụng chỉ cần để trong thựng đỏ, một tuần gửi mẫu/lần).
Hỡnh 2.2. Cỏch lấy mẫu bệnh phẩm dịch lợi
2.2.6. Xỏc định và định lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitan và P. gingivalis bằng kỹ thuật realtime PCR gingivalis bằng kỹ thuật realtime PCR
2.2.6.1. Dụng cụ, trang thiờ́t bị
- Mỏy Realtime PCR của hóng Eppendorf. - Tủ lạnh sõu: -300
C; -800C (SANYO).
- Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và ly tõm để bàn Eppendorf (Đức). - Mỏy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hóng Biomate. - Mỏy đo nồng độ acid nucleic Nano Drop 1000 (Mỹ).
- Lũ vi súng (Samsung). - Tủ ấm.
- Pippet, đầu cụn cỏc loại. - ễ́ng Eppendorf.
2.2.6.2. Hoỏ chất
Hoỏ chất dựng để tỏch chiết DNA tổng số (Wako):
- Dung dịch lysis buffer. - Dung dịch K.
- Dung dịch SDS 10%. - Proteinase K (10mg/l).
- Dung dịch phenol: cloroform: isoamyl (25:24:1). - Dung dịch cloroform: isoamyl (24:1).
- Sodium acetate 3M, pH 5,2. - Ethanol 100% và ethanol 70%. - Dung dịch TE. Húa chất Realtime PCR: - Ex-Taq buffer. - dNTP.
- Ex Taq polymerase (Takara, Japan).
- Taqman probe mồi xuụi. - Taqman probe mồi ngược.
2.2.6.3. Định lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitan và P. gingivalis
- Tỏch chiết DNA
Mẫu bệnh phẩm (dịch lợi) được rửa trong 1ml dịch PBS, ly tõm lấy cặn
và tiến hành tỏch chiết DNA từ dịch cặn bằng bộ Kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN-USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hỡnh 2.3. Kit QIAamp DNA Mini tỏch chiết DNA
Qui trỡnh tỏch chiết DNA:
1. Đặt mẫu vào ống Axygen, thờm 200 àl PBS 1X vào từng ống. Ủ khoảng 2-5 phỳt trong mỏy ủ.
2. Thờm 10 àl protease K và 200 àl dung dịch đệm AL. Trộn đều bằng cỏch lắc nhẹ 15 giõy. Ly tõm nhẹ 3 giõy.
3. Ủ 56oC 10 phỳt. Ly tõm nhẹ 3 giõy.
4. Thờm 200 àl Ethanol 100% lạnh vào rồi lắc nhẹ. Ly tõm nhẹ khoảng 3 giõy.
5. Cho tất cả hỗn hợp này vào ống (1) cú chứa QIAGEN (ống QIAGEN: 610àl). Đậy nắp ống (1) lại. Quay ly tõm 8.000 vũng trong 1 phỳt.
6. Lấy cỏc chất cú trong ống (1) cho vào 1 ống mới (ống 2), bỏ ống (1) đi.
7. Cho 500 àl dung dịch rửa AW1 vào ống (2). Ly tõm 8.000 vũng trong 1 phỳt.
8. Lại lấy cỏc chất trong ống (2) cho vào 1 ống mới (ống 3), bỏ ống (2).
9. Cho 500 àl dung dịch rửa AW2 vào ống (3). Ly tõm 14.000 vũng 3 phỳt.
10. Lấy cỏc chất trong ống (3) cho vào 1 ống Axygen mới (ống 4), bỏ ống (3).
11. Ly tõm 14.000 vũng 1 phỳt. Lấy ống (4) cho vào 1 ống mới (ống 5), bỏ ống (4). Cho 100 àl dung dịch hũa tan AE vào ống (5). Ủ khoảng 1 phỳt ở nhiệt độ phũng, quay ly tõm 8.000 vũng trong 1 phỳt để ly trớch được DNA.
12. Kiểm tra DNA sau tỏch chiết:
Độ tinh khiết của dung dịch DNA được xỏc định bằng tỷ lệ giữa độ hấp thụ quang của dung dịch DNA ở bước súng 260 nm và 280 nm (A260/A280). Độ tinh khiết tốt nhất trong khoảng 1,8 – 2,0.
Độ tinh khiết được kiểm tra song song bằng điện di dung dịch DNA trờn gel agarose 1%.
Chu kỳ Kết quả TaqMan bịhủy phõn Sản phẩm PCR Mồi xuụi Mồi ngược phảnứng khuếch đại Loại bỏprobe, giải phúng florescence A B - Kỹ thuật realtime-PCR
Kỹ thuật realtime PCR được sử dụng để định lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis trước điều trị, sau điều trị 2 tuần và sau
điều trị 12 tuần.
• Nguyờn lý của Realtime PCR:
Realtime PCR dựa trờn nguyờn tắc PCR cơ bản của kỹ thuật PCR truyền thống, trong đú ngoài hai mồi đặc hiệu cú thờm DNA probe (đoạn dũ) - là đoạn DNA đặc hiệu với vựng gen đớch cú gắn thờm chất phỏt quang (Flourescent) và ức chế phỏt quang (Quencher) trờn đầu 5’ và 3’, do luụn ở gần nhau nờn Quencher luụn ức chế tớn hiệu của Flourescent. Khi phản ứng xảy ra, nhờ tớn hiệu endonuclease của Taq-polymeares trong phản ứng làm thủy phõn DNA-probe, Flourescent được giải phúng khỏi Quencher, tớn hiệu huỳnh quang tăng dần sau mỗi chu kỳ phản ứng và được ghi nhận trờn mỏy phõn tớch.
Hỡnh 2.4. Nguyờn tắc hoạt động của TaqMan trong Realtime-PCR
A. Nguyờn tắc hoạt động của TaqMan;
• Thiết kế cặp mồi và probe:
Đoạn mồi và đầu dũ cú trỡnh tự nucleotid trờn 16S rDNA của hệ vi
khuẩn trong miệng, gen rgpA của A. Actinomycetemcomitans ATCC 29522,
gen fimA của P. gingivalis ATCC 33277 được lấy từ ngõn hàng gen trờn thế
giới (Genbank).
Cỏc trỡnh tự mồi và probe (Taqman probe) được thiết kế, khảo sỏt cỏc đặc tớnh về nhiệt độ núng chảy (Tm), % GC, cấu trỳc thứ cấp bằng phần mềm Beacon designer tại Trung tõm nghiờn cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. Kết quả cỏc thụng số phải nằm trong giới hạn cho phộp để đảm bảo sự hoạt động tốt nhất của mồi và đầu dũ. Cỏc trỡnh tự mồi cũng được BLAST với cỏc trỡnh gen trờn QRBI để kiểm tra độ tương đồng của chỳng với cỏc trỡnh tự gen đớch của A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis và hệ vi khuẩn trong miệng.
Mồi được lựa chọn khi kết quả cho thấy cỏc trỡnh tự cú độ tương đồng 100% với DNA genome 16S rDNA của hệ vi khuẩn trong miệng A. Actinomycetemcomitans và P. gingivalis.
Bảng 2.4. Trỡnh tự của mồi và probe sử dụng cho kỹ thuật realtime PCR
Hệ vi khuẩn trong miệng (gen nội chuẩn 16Sr
DNA)
Chiều xuụi GTT GTT AAG GGT GCG TAG GGT TTA C
Chiều ngược CTG CCG CCA CTG AAC TCA A
Probe FAM CCT GAG TCA GCG GTG AAA GGT AAG CG
A.actinomycetemcomitans
(gen lkt)
Chiều xuụi CAAGTGTGATTAGGTAGTTGGTGGG
Chiều ngược CCTTCCTCATCACCGAAAGAA
Probe FAM ATCGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGGCC
P. gingivalis (gen rgpA)
Chiều xuụi AAACGACGATTAATACCACATGAGAC
Chiều ngược ACTCGTATCGCCCGTTATTC
• Thành phần phản ứng realtime PCR:
Thành phần Thờ̉ tích (l)
Nước cất PCR 11,3
Buffer 10X 2,0
dNTP (2,5 mM) 2,0
Mồi xuụi (pmol/àl) 0,5
Mồi ngược (pmol/àl) 0,5
Probe (pmol/àl) 0,5
Taq polymerase (5 u/l) 0,2
DNA (20ng) 3,0
Tổng 20,0
• Chu trỡnh nhiệt của phản ứng Realtime PCR:
Chu trỡnh Biờ́n tính Bắt cặp Tổng hợp 1 94oC - 5 phỳt
2 94oC - 30 giõy 60oC – 1 phỳt 40 chu kỳ Bảo quản ở 10oC
• Cỏch tớnh lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitans (Aa), P. gingivalis (Pg): Nghiờn cứu này định lượng tương đối tỷ lệ A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis trong tổng số hệ vi khuẩn. Cỏch tớnh lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis theo phương phỏp so sỏnh chu kỳ
ngưỡng (Ct):
Ct của cỏc vi khuẩn 16S rDNA Ct của Aa (hoặc Pg) Tỉ lệ Aa (hoặc Pg)=
Theo cụng thức trờn, khi chu kỳ ngưỡng (Ct) phỏt hiện P. gingivalis
càng thấp, tỷ lệ P. gingivalis càng tăng cho biết số lượng P. gingivalis trong
bệnh phẩm càng nhiều. Điều này phự hợp số lượng P. gingivalis nhiều hơn thỡ cần ớt chu kỳ nhiệt khuếch đại hơn.