Cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử

Những xột nghiệm sinh học phõn tử giỳp chẩn đoỏn một cỏch chắc chắn cỏc vi khuẩn gõy bệnh VQR, giỳp bỏc sĩ đưa ra kế hoạch điều trị phự hợp nhất

để giảm chi phớ và thời gian điều trị, giảm những biến chứng của bệnh VQR. PCR là một kỹ thuật rất nhanh, nhạy và đặc hiệu cho phộp xỏc định nhanh và chớnh xỏc DNA của vi khuẩn trong vài giờ. Trờn thế giới hiện nay, chẩn đoỏn xỏc định bệnh VQR bằng cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử để phỏt hiện sự cú mặt của vi khuẩn A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis cựng cỏc gen độc tố gõy bệnh khỏc nhau của chỳng đó được triển khai khỏ rộng rói, cỏc nghiờn cứu đều cho thấy cỏc kỹ thuật sinh học phõn tử cú độ nhạy hơn rất nhiều so với kỹ thuật nuụi cấy cổ điển [8],[24],[59],[60]. Nghiờn cứu của Doungugomdacha (2000) trờn 12 mẫu mảng bỏm răng của cỏc bệnh nhõn VQR mạn tớnh sử dụng kỹ thuật PCR đó phỏt hiện được vi khuẩn P. gingivalis trong 6 mẫu bệnh phẩm, song song bằng kỹ thuật nuụi cấy P. gingivalis dương tớnh trờn 1 mẫu bệnh phẩm [61].

Kỹ thuật real-time PCR là kỹ thuật PCR mà sản phẩm khuếch đại DNA đớch hiển thị cựng lỳc mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, nờn được gọi là PCR thời gian thực [59],[60]. Realtime PCR định lượng được DNA đớch nờn cũn gọi là PCR định lượng (qPCR). Verner và c.s. (2006) nhận định qPCR nhạy hơn kỹ thuật nuụi cấy [62]. Tỉ lệ vi khuẩn phỏt hiện bằng real-time PCR cao hơn kỹ thuật nuụi cấy, mức độ chờnh lệch trong định lượng DNA giữa kỹ thuật realtime PCR với kỹ thuật nuụi cấy lần lượt là 51,4% đối với P. gingivalis, 36,1% đối với T. forsythensis, 12,5% đối với F. nucleatum, 8,3%

đối với P. intermedia, 3% đối với A. actinomycetemcomitans [62].

Cú hai cỏch định lượng DNA đớch: định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối [59],[60].

- Định lượng tuyệt đối: kỹ thuật định lượng này đũi hỏi phải biết rừ về

thể tớch hay trọng lượng của mẫu bệnh phẩm. Người thực hiện xột nghiệm realtime PCR phải tiến hành trờn mẫu bệnh phẩm cựng với cỏc mẫu chuẩn đó biết trước số lượng rồi tớnh ra số copies của DNA đớch cú trong ống phản ứng dựa vào đường biểu diễn chuẩn xỏc định mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng

(Ct) với số lượng copies DNA ban đầu cú trong ống phản ứng. Cuối cựng, việc xỏc định số copies của DNA đớch cú trong mẫu bệnh phẩm dựa vào hệ số pha loóng mẫu hay hệ số tỏch chiết DNA của kỹ thuật chuẩn bị mẫu trước khi thực hiện realtime PCR.

- Định lượng tương đối: kỹ thuật định lượng này khụng đũi hỏi phải biết

rừ về thể tớch hay trọng lượng của mẫu bệnh phẩm, thụng số định lượng là chu kỳ ngưỡng (Ct) [60].

Vớ dụ: kỹ thuật realtime PCR định lượng tương đối cho kết quả tỉ lệ

A. actinomycetemcomitans hay P. gingivalis trờn tổng số cỏc vi khuẩn trong

mẫu bệnh phẩm, được tớnh theo phương phỏp so sỏnh chu kỳ ngưỡng [6]: Ct của cỏc vi khuẩn 16S rDNA

Theo cụng thức trờn, khi chu kỳ ngưỡng (Ct) phỏt hiện P. gingivalis

càng thấp, tỉ lệ P. gingivalis càng tăng thỡ số lượng P. gingivalis trong bệnh

phẩm càng nhiều bởi số lượng P. gingivalis càng nhiều thỡ cần càng ớt chu kỳ nhiệt khuếch đại hơn.

Kỹ thuật PCR cú thể phỏt hiện bất cứ loại vi khuẩn nào, kể cả khi vi khuẩn khụng cũn sống hoặc khi bệnh nhõn đó sử dụng khỏng sinh trước khi làm xột nghiệm. Định lượng vi khuẩn khụng chỉ giỳp ớch trong chẩn đoỏn bệnh VQR mà cũn giỳp đỏnh giỏ hiệu quả điều trị, theo dừi sự tiến triển của bệnh.

Ct của P. gingivalis Tỉ lệ P. gingivalis =

Chương 2

PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU

70 bệnh nhõn đến khỏm, được chẩn đoỏn và điều trị VQR tại Khoa Nha

chu của Bệnh viện Răng Hàm Mặt tp. Hồ Chớ Minh từ 01/10/2011 đến 30/10/2014.

2.1.1. Tiờu chuẩn chọn mẫu

- Tuổi ≥ 30.

- Chẩn đoỏn xỏc định VQR món tớnh dạng toàn thể, cú tỳi quanh răng ≥ 3mm, đang trong thời kỳ hoạt động biểu hiện bằng viờm lợi, chảy mỏu tỳi khi thăm khỏm bằng cõy đo tỳi Miller.

- Cũn tối thiểu 20 răng.

- Khụng cú tiền sử bệnh tim mạch, đỏi thỏo đường, bệnh nội tiết, bệnh chuyển húa.

- Khụng sử dụng thuốc khỏng sinh, khỏng viờm, thuốc trỏnh thai trước khi tham gia nghiờn cứu 1 thỏng.

- Khụng điều trị bệnh lý quanh răng trước khi tham gia nghiờn cứu 12 tuần.

- Khụng cú thúi quen hỳt thuốc lỏ. - Đồng ý tham gia nghiờn cứu.

- Lấy được bệnh phẩm để làm xột nghiệm realtime PCR, xỏc định và định lượng được hai vi khuẩn A.actinomycetemcomitans, P.gingivalis trong

mẫu bệnh phẩm.

2.1.2. Tiờu chuẩn loại trừ

- Đang cú ỏp xe quanh răng.

- Bệnh nhõn mắc bệnh tõm thần, HIV, bệnh toàn thõn mạn tớnh (tiết niệu, thấp khớp).

- Đang cú thai hoặc cho con bỳ.

- Bệnh nhõn khụng đồng ý tham gia nghiờn cứu hoặc khụng lấy được bệnh phẩm. Kết quả xột nghiệm realtime PCR chỉ cú

A.actinomycetemcomitans hoặc P.gingivalis.

2.2. Phương phỏp nghiờn cứu 2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu 2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu

- Thử nghiệm lõm sàng, đỏnh giỏ kết quả trước – sau điều trị. Bệnh nhõn VQR mạn tớnh dạng toàn thể thỏa món cỏc tiờu chuẩn chọn mẫu, được lấy mẫu bệnh phẩm (dịch khe lợi) vào cỏc thời điểm: Ngày đầu tiờn, Sau 02 tuần và sau 12 tuần.

2.2.2. Cỡ mẫu nghiờn cứu

Nghiờn cứu của chỳng tụi được thiết kế thực nghiệm lõm sàng trờn một nhúm bệnh nhõn và đỏnh giỏ kết quả trước - sau điều trị, cỏch tớnh cỡ mẫu:

N = Z²1-α/2 P(1-P)/d² với độ chớnh xỏc d=10%, độ tin cậy 95%, P là tỷ lệ điều trị đạt kết quả theo tiờu chuẩn hết VQR khoảng 80%, α=0,05, Z2

1-α/2

=1,96², cỡ mẫu tối thiểu là 62 bệnh nhõn. Để tăng độ chớnh xỏc và giảm sai lầm do kỹ thuật, mẫu chớnh thức là 70 bệnh nhõn [63],[69],[94]. 70 bệnh nhõn VQR mạn tớnh dạng toàn thể thỏa món cỏc tiờu chuẩn chọn mẫu, bệnh phẩm gồm 210 mẫu dịch khe lợi (70 bệnh nhõn VQR x 3 lần lấy mẫu). Tiến hành chọn mẫu tớch lũy theo thời gian đến khi đủ cỡ mẫu nghiờn cứu.

2.2.3. Cỏc bước tiến hành nghiờn cứu

Ngày đầu tiờn (Thời điờ̉m T₀):

(1) Khỏm, đỏnh giỏ cỏc chỉ số lõm sàng: -Viờm lợi (GI)

-Độ mất bỏm dớnh lõm sàng (CAL) -Răng lung lay

-Đỏnh giỏ mức độ và dạng tiờu xương ổ răng: chụp phim toàn cảnh kỹ thuật số (Panorex).

(2) Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 1.

(3) Hướng dẫn bệnh nhõn cỏch vệ sinh răng miệng: chải răng theo kỹ thuật Bass cải tiến, sử dụng chải mềm và kem đỏnh Colgate Total. Đưa cho bệnh nhõn tờ rơi nhắc nhở về cỏch chải răng (Phụ lục).

Sau 1 tuần: khi cú kết quả realtime PCR

- Điều trị theo phỏc đồ cho bệnh nhõn. - Hẹn bệnh nhõn tỏi khỏm sau 1 tuần. Sau 2 tuần (Thời điờ̉m T₁):

- Bệnh nhõn tỏi khỏm, đỏnh giỏ cỏc chỉ số lõm sàng, duy trỡ cỏc phương phỏp hỗ trợ cơ học.

- Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn

A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 2.

- Hẹn bệnh nhõn tỏi khỏm sau 04 tuần, 08 tuần, 12 tuần (mốc hẹn bệnh nhõn là thời điểm T₀).

Sau 12 tuần (Thời điờ̉m T2):

- Bệnh nhõn tỏi khỏm, đo cỏc chỉ số trờn lõm sàng, chụp phim toàn cảnh. - Lấy mẫu bệnh phẩm làm xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn

A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis lần 3.

2.2.4. Phương phỏp thu thập dữ liệu lõm sàng

2.2.4.1. Tiờu chuẩn chẩn đoỏn VQR món tớnh dạng toàn thờ̉ [1], [8]

-Tỳi quanh răng ≥ 3mm, đang hoạt động (chảy mỏu khi thăm dũ) -Răng lung lay độ I - III

-Giảm chiều cao của mào xương ổ răng: 3 mm < mào xương ổ răng (trờn phim Panorex kỹ thuật số).

-Khi tổn thương hiện diện > 30% cỏc răng trờn cung hàm.

2.2.4.2. Tiờu chuẩn xỏc định hờ́t VQR món tớnhdạng toàn thờ̉

Để đỏnh giỏ kết quả sau điều trị, chỳng tụi dựa vào cỏc tiờu chớ sau: -Tỡnh trạng lợi viờm: chỉ số GI và chỉ số PLI

-Độ sõu tỳi lợi (PPD).

-Tỡnh trạng xương ổ răng sau điều trị.

-Kết quả xột nghiệm realtime PCR định lượng vi khuẩn

A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis õm tớnh hoặc cú số lượng rất ớt

(chuẩn định lượng õm tớnh hoặc < 100 copy/mẫu).

Đỏnh giỏ kết quả sau điều trị được chia làm 3 mức độ: tốt, khỏ, trung bỡnh.

Đỏnh giỏ kờ́t quả sau 2 tuần (Thời điờ̉m T1):

- Mức độ tốt: lợi hết viờm, màu hồng, săn, khụng chảy mỏu khi thăm khỏm, răng sạch khụng cú mảng bỏm răng:

* Chỉ số GI: 0 - 0,1 * Chỉ số PLI: 0 - 0,1.

- Mức độ khỏ:

Lợi viờm nhẹ, màu hồng nhạt, chảy mỏu khi thăm khỏm, cú rất ớt mảng bỏm răng.

* Chỉ số GI: 0,1 - 0,9 * Chỉ số PLI: 0,1 - 0,9.

- Mức độ trung bỡnh:

Tỡnh trạng lợi khụng được cải thiện. * Chỉ số GI ≥ 1.

Đỏnh giỏ kờ́t quả điều trị sau 12 tuần: - Mức độ tốt:

+ Lợi bỡnh thường, khụng viờm chải răng khụng chảy mỏu, răng sạch khụng cú mảng bỏm răng: GI: 0-0,1; PLI: 0-0,1.

+ Xương ổ răng giữ nguyờn mức tiờu xương.

- Mức độ khỏ:

+ Lợi khụng viờm, chải răng khụng chảy mỏu cú rất ớt mảng bỏm răng: GI: 0,1-0,9; PLI: 0,1-0,9.

+ Độ sõu tỳi lợi giảm cũn 2/5 - < 3/5 so với trước khi điều trị. + Xương ổ răng tiờu thờm dưới 20%.

- Mức độ trung bỡnh:

+ Tỡnh trạng lợi khụng được cải thiện. + Tỳi quanh răng như cũ hoặc sõu hơn. + Xương ổ răng tiờu thờm trờn 20%. Cỏc chỉ số lõm sàng

♦ Chỉ số mảng bỏm (Plaque Index - PLI): là chỉ số đỏnh giỏ độ dày của

mảng bỏm trờn mặt răng theo Silness và Lửe (1964) [1],[11].

- Cỏch đỏnh giỏ: mặt răng chia thành 4 vựng gồm mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần và mặt trong. Thổi khụ cỏc răng trước khi đỏnh giỏ chỉ số mảng bỏm.

- Đọc kết quả:

Bảng 2.1. Tiờu chuẩn chỉ số mảng bỏm [1],[11] Điểm số Tiờu chuẩn chỉ số mảng bỏm (PLI)

0 Khụng cú mảng bỏm.

1 Mảng bỏm khụng thấy được bằng mắt thường, nhưng thấy được khi dựng cõy đo tỳi cạo trờn bề mặt răng từ khe lợi.

2 Mảng bỏm mỏng hay trung bỡnh, phủ mặt răng, thấy bằng mắt thường.

3 Mảng bỏm dày, mảnh vụn thức ăn nhiều trong tỳi lợi.

Cho điểm số từ 0 đến 3 ở 4 vựng của một răng theo bảng 2.1. Điểm PLI trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng điểm PLI của 4 vựng răng chia cho 4.

- Ngưỡng đỏnh giỏ: Rất tốt (sạch): 0 điểm Tốt: 0,1 ữ 0,9 điểm Trung bỡnh: 1 ữ 1,9 điểm Kộm: 2,0 ữ 3,0 điểm

♦ Chỉ số lợi (Gingival Index - GI)

- Mục đớch: Đỏnh giỏ mức độ viờm lợi theo chỉ số GI của Silness & Lửe (1967).

Bảng 2.2.Tiờu chuẩn chỉ số lợi [1],[11]

Điểm số Tiờu chuẩn chỉ số lợi (GI)

0 Lợi bỡnh thường

1 Lợi đổi màu, khụng chảy mỏu khi thăm dũ 2 Lợi sưng, đỏ, chảy mỏu khi thăm dũ

3 Lợi sưng đỏ, lở loột, dễ chảy mỏu tự phỏt

• Cỏch đỏnh giỏ: Khỏm mụ lợi ở 4 vựng: rónh lợi ngoài gần, giữa, xa và mặt trong. Khụng đỏnh giỏ ở răng 8.

• Đọc kết quả: Cho điểm số từ 0 đến 3 theo bảng 2. Điểm GI trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng điểm GI bốn vựng răng chia cho 4.

Ngưỡng đỏnh giỏ:

Rất tốt (lợi lành mạnh) : 0

Tốt : 0,1 - 0,9 Trung bỡnh : 1,0 - 1,9 Kộm ( nặng) : 2,0 - 3,0

♦ Độ sõu tỳi (Periodontal probing depth - PPD)

• Định nghĩa: PPD là khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến bờ lợi tự do [1],[11]. • Cỏch đỏnh giỏ:

-Đo độ sõu của tỳi quanh răng bằng cõy đo tỳi của William (Hỡnh 2.1) [62].

-Đo khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến bờ lợi tự do tại 4 vị trớ trờn mỗi răng: mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần, mặt trong.

-Cỏch đo tỳi: Đặt cõy đo tỳi William cú chia vạch millimet tại 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 và 10 mm; với ỏp lực nhẹ nhàng vào khe lợi sao cho song song với trục dọc của răng. Di chuyển cõy đo tỳi dọc theo chu vi mỗi mặt răng, ghi nhận độ sõu tỳi tại bốn vị trớ.

• Đọc kết quả:

- Độ sõu tỳi được đọc ở mức vạch trờn cõy đo tỳi ngang mức đỉnh bờ lợi tự do.

- Độ sõu tỳi trung bỡnh của mỗi răng bằng tổng số độ sõu tỳi của bốn vị trớ quanh răng chia cho 4.

♦ Mất bỏm dớnh lõm sàng (Clinical attachment loss - CAL)

• Định nghĩa: mất bỏm dớnh lõm sàng là khoảng cỏch từ đỏy tỳi đến đường nối men-xờ măng [1],[11].

• Cỏch đỏnh giỏ: Đặt cõy đo tỳi đo từ đỏy tỳi đến đường nối men-xờ măng của răng tại 4 vị trớ trờn mỗi răng: mặt ngoài xa, mặt ngoài, mặt ngoài gần, mặt trong.

• Đọc kết quả:

-CAL được đọc ở mức vạch trờn cõy đo tỳi tại đường nối men-xờ măng.

-CAL trung bỡnh ở mỗi răng bằng tổng CAL tại 4 vị trớ quanh răng chia cho 4.

Hỡnh 2.1. Cõy đo túi William ♦ Độ lung lay của răng

Đỏnh giỏ mức độ lung lay răng theo Miller được ghi nhận theo bảng 2.3. [1],[11].

Bảng 2.3. Mức độ lung lay của răng

Độ Mức độ lung lay của răng

0 Răng khụng lung lay

1 ^{Cảm giỏc răng lung lay}

2 Răng lung lay nhỡn thấy theo chiều ngoài - trong

3

Răng lung lay nhỡn thấy theo cỏc chiều (ngoài - trong, gần-xa và theo trục răng).

2.2.5. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

- Cỏc vật liệu (gũn cuộn, cụn giấy số 30) và dụng cụ đều được khử khuẩn. - Lấy bệnh phẩm dịch lợi ở tỳi quanh răng cú chảy mỏu khi thăm khỏm và sõu nhất trong cỏc tỳi khi thăm dũ vào ngày đầu tiờn trong nghiờn cứu.

- Cỏch lấy bệnh phẩm dịch lợi: cỏch ly nước bọt với vựng răng lấy mẫu bằng gũn cuộn. Sau khi lau sạch mảng bỏm trờn lợi và thổi nhẹ cho khụ, đưa 5 cõy cụn giấy số 30 và dài 21 mm vụ trựng vào đến đỏy tỳi (thao tỏc nhẹ, trỏnh chảy mỏu), để trong 10 giõy, lấy cụn giấy ra và cho vào lọ effendorf cú nắp đậy (Hỡnh 2.2). Một bệnh nhõn được lấy mẫu 03 lần, tại cỏc thời điểm T₀, T_1, T2 tại cựng một vị trớ (lưu hỡnh chụp trong bệnh ỏn).

Mỗi vị trớ lấy mẫu bệnh phẩm sử dụng một bộ dụng cụ riờng để trỏnh sự lõy nhiễm chộo. Mẫu vi khuẩn A.actinomycetemcomitans và P.gingivalis

được lấy trờn bệnh nhõn VQR tại khoa Nha chu của Bệnh viện Răng Hàm Mặt tp.Hồ Chớ Minh, sau đú được tỏch triết DNA và bảo quản ở tủ lạnh sõu (nhiệt độ -80⁰C - tủ chuyờn biệt SANYO) tại khoa xột nghiệm của bệnh viện cho đến khi thực hiện phõn tớch tại Trung tõm nghiờn cứu Gen-Protein của trường Đại học Y Hà Nội (khi gửi mẫu ra Hà Nội theo đường hàng khụng chỉ cần để trong thựng đỏ, một tuần gửi mẫu/lần).

Hỡnh 2.2. Cỏch lấy mẫu bệnh phẩm dịch lợi

2.2.6. Xỏc định và định lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitan và P. gingivalis bằng kỹ thuật realtime PCR gingivalis bằng kỹ thuật realtime PCR

2.2.6.1. Dụng cụ, trang thiờ́t bị

- Mỏy Realtime PCR của hóng Eppendorf. - Tủ lạnh sõu: -300

C; -80⁰C (SANYO).

- Mỏy ly tõm lạnh Beckman (USA) và ly tõm để bàn Eppendorf (Đức). - Mỏy quang phổ kế Thermo Electron Corporation của hóng Biomate. - Mỏy đo nồng độ acid nucleic Nano Drop 1000 (Mỹ).

- Lũ vi súng (Samsung). - Tủ ấm.

- Pippet, đầu cụn cỏc loại. - ễ́ng Eppendorf.

2.2.6.2. Hoỏ chất

Hoỏ chất dựng để tỏch chiết DNA tổng số (Wako):

- Dung dịch lysis buffer. - Dung dịch K.

- Dung dịch SDS 10%. - Proteinase K (10mg/l).

- Dung dịch phenol: cloroform: isoamyl (25:24:1). - Dung dịch cloroform: isoamyl (24:1).

- Sodium acetate 3M, pH 5,2. - Ethanol 100% và ethanol 70%. - Dung dịch TE. Húa chất Realtime PCR: - Ex-Taq buffer. - dNTP.

- Ex Taq polymerase (Takara, Japan).

- Taqman probe mồi xuụi.