2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa. Thu hái,
làm tiêu bản và lƣu giữ tiêu bản.
- Xác định tên khoa học của cây nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm
21
thực vật [3], [6], [10] cùng với sự hỗ trợ của nhà khoa học chuyên ngành thực vật học.
- Nghiên cứu các đặc điểm vi học:
Vi phẫu cành và lá của cây Tốc thằng cáng
Phƣơng pháp làm tiêu bản tạm thời [15]:
Dƣợc liệu khô đƣợc ngâm mềm, cắt ngang thành lát cắt mỏng. Sau đó tiến hành ngâm nƣớc Javen 30 phút để tẩy các chất trong các tế bào. Tiếp tục rửa với nƣớc nhiều lần, rồi với acid acetic và cuối cùng đƣợc rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm vi phẫu thu đƣợc bằng xanh methylene trong khoảng thời gian 15-30 giây và nhanh chóng rửa lại bằng nƣớc. Đỏ carmine đƣợc sử dụng cho lần nhuộm tiếp theo trong khoảng 30 phút. Tiêu bản sau nhuộm đƣợc rửa lại với nƣớc. Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính. Sau đó, tiến hành soi tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả các đặc điểm của vi phẫu.
Soi bột thân và lá của cây Tốc thằng cáng
Dƣợc liệu sau khi thu hái đƣợc sấy khô, nghiền mịn thành bột, rây cho bột có kích thƣớc thích hợp. Tiếp theo, bột dƣợc liệu đƣợc đặt lên trên phiến kính có sẵn giọt nƣớc cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dƣới kính hiển vi quang học. Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm bột dƣợc liệu [15].
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.3.2.1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dƣợc liệu
Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phƣơng pháp sàng lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng [1], [4].
- Định tính alcaloid: Cho khoảng 5g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung dịch NH4OH 6N. Sau 30 phút, thêm chloroform ngập dƣợc liệu, lắc, đậy kín. Ngâm 12h, gạn dịch chloroform vào bình gạn, lắc kỹ với
dung dịch H2SO4 1N, gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng. Cho 1ml dịch
chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử lần lƣợt:
+ Thuốc thử Dragendorff: cho tủa màu da cam. + Thuốc thử Mayer: cho tủa trắng.
22
- Định tính flavonoid: Lấy khoảng 1g dƣợc liệu cho vào ống nghiệm, thêm cồn
90o, đun sôi cách thủy vài phút. Lọc nóng, dịch lọc để làm các phản ứng định tính:
+ Phản ứng Cyanidin (phản ứng khử hóa): Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đặc rồi đun nóng cách thủy, khoảng vài phút sau xuất hiện màu hồng hơi tím.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết,
thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện tủa màu xanh nâu.
+ Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH3: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi hơ lên lọ
NH3 đặc, thấy màu vàng đậm hơn lên. Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10%
- Định tính glycosid tim: Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 10g dƣợc
liệu, thêm 50ml cồn 25o, ngâm 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết. Loại tạp bằng dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chì acetat 30% dƣ. Loại chì acetat thừa bằng Na2SO4 bão hòa, đến khi không còn
tủa với Na2SO4 nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ 3 lần với chloroform,
mỗi lần 20ml. Gạn lấy dịch chloroform cho vào cốc thủy tinh, loại nƣớc bằng cách lọc qua bông. Dịch chiết trong, không lẫn nƣớc. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc để làm phản ứng định tính glycosid tim.
+ Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, thêm vài giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, lắc, thấy xuất hiện màu hồng. Phản ứng dƣơng tính.
+ Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet, thấy xuất hiện màu đỏ da cam. Phản ứng dƣơng tính.
+ Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic. Đặt
nghiêng ống nghiệm 45o
, cho thêm đồng lƣợng acid sulfuric đặc theo thành ống để dịch lọc trong ống nghiệm đƣợc chia thành 2 lớp. Giữa 2 lớp xuất hiện vòng tím đỏ.
+ Phản ứng Keller-Kiliani: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol
23
Nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ vào thành ống nghiệm 0,5ml acid H2SO4 đặc,
tránh xáo trộn lòng ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai chất lỏng xuất hiện một vòng màu nâu đỏ.
- Định tính coumarin: Chiết xuất coumarin bằng cồn 96o, lọc, dịch lọc để làm các phản ứng:
+ Phản ứng mở - đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết. Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% vào ống 1, ống thứ 2 để nguyên. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, quan sát hiện tƣợng. Tiếp tục để nguội rồi thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml nƣớc cất. Lắc đều, quan sát quá trình:
Ống 1: có tủa đục màu vàng → trong suốt. Ống 2: trong → có tủa đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, thấy có tủa đục nhƣ ống 2.
+ Phản ứng diazo hóa: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Đun sôi cách thủy vài phút. Lấy ra để nguội rồi cho thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Diazo mới pha, thấy xuất hiện màu đỏ.
- Định tính Saponin: Cho 5g dƣợc liệu vào bình nón 100ml, chiết bằng 30ml
cồn 900, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết cồn để làm phản ứng:
+ Quan sát hiện tƣợng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết vào ống nghiệm có 5ml nƣớc, lắc mạnh trong 2 phút, cột bọt cao bền trong 15 phút.
+ Phản ứng Salkowski: Dịch lọc cho vào ống nghiệm. Để nghiêng ống
nghiệm 45o
, cho từ từ vào thành ống nghiệm 1-2 giọt acid H2SO4 đậm đặc, thấy
xuất hiện màu tím hồng.
- Định tính anthranoid: Lấy khoảng 3g dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích
100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10%. Đun sôi trực tiếp 15 phút. Lọc nóng vào
bình gạn, để nguội, lắc với 5ml chloroform. Gạn lớp chloroform để làm phản ứng Bortraeger. Cho 1ml dịch chloroform vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ, thấy xuất hiện màu tím đỏ. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính tanin: Cho khoảng 1g dƣợc liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi trực tiếp vài phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc làm các phản ứng sau:
24
+ Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phản ứng với dung dịch Chì acetate 10%, xuất hiện tủa bông.
+ Phản ứng với FeCl3 5%: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm một vài
giọt dung dịch FeCl3, xuất hiện tủa xanh đen.
- Định tính acid carboxylic: Cho bột dƣợc liệu vào ống nghiệm, thêm nƣớc
cất, đun sôi trong vài phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc 1 ít bột Na2CO3 thấy
có bọt khí CO2.
- Định tính đường khử: Cho 2g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi cách thủy vài phút, lọc lấy dịch. Cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A + 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun sôi cách
thủy 10 phút,xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính chất béo: Cân khoảng 10g dƣợc liệu cho vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Shoxhlet, chiết hồi lƣu với dung môi là ether dầu hỏa trong 3 giờ, thu đƣợc dịch lọc. Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy trắng, hơ nóng giấy lọc trên bếp điện, vết mờ còn lại trên giấy. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính acid amin: Cho khoảng 2g dƣợc liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi cách thủy 5 phút, lọc nóng. Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi vài phút, xuất hiện màu tím.
- Định tính steroid: Bằng phản ứng Liebermann.
2.3.2.2. Phƣơng pháp chiết xuất
a. Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần
Dịch chiết toàn phần thu đƣợc bằng cách sử dụng methanol làm dung môi chiết xuất. Bột dƣợc liệu đƣợc ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng, mỗi đợt chiết kéo dài trong vòng 05 ngày sau đó thay methanol mới và tiến hành đợt chiết tiếp theo. Kết thúc 3 đợt chiết, dịch chiết đƣợc gộp lại và đƣợc tiến hành bốc hơi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc cao toàn phần [2], [4], [16].
25
Phƣơng pháp chiết xuất phân đoạn thực hiện bằng bình gạn thủy tinh. Phân tán cao toàn phần trong nƣớc. Tiến hành lắc phân đoạn với các dung môi hữu cơ có độ
phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform, ethyl acetate trong bình gạn, thu đƣợc lần
lƣợt các phân đoạn n-hexane, chloroform, ethyl acetate và phần nƣớc còn lại. Bốc
hơi dung môi trong máy cô quay thu đƣợc cao cắn tƣơng ứng của từng phân đoạn [2], [4], [16].
2.3.2.3. Phƣơng pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt đƣợc sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [2], [4], [13]. Sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải.
a. Sắc ký cột hấp phụ
- Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy mà có thể triển khai liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [2], [4], [13].
Chất nhồi cột là silica gel pha thƣờng (Silica gel 60, 0,040-0,063 mm (230- 400 mesh ASTM), Merck), silica gel pha đảo YMC (Silica gel 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.).
b. Sắc ký lọc qua gel
- Nguyên tắc: Sắc ký lọc qua gel là phƣơng pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thƣớc của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó đƣợc pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thƣớc lỗ của gel xác định khoảng kích thƣớc phân tử đƣợc phân tách qua quá trình sắc ký [2], [4], [13].
Sử dụng chất nhồi cột là Sephadex LH-20.
c. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thƣờng (TLC-Silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo (YMC RP-18, Merck).
26 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình chạy sắc ký, phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau [2], [4], [13].
Các chất đƣợc phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 366 nm
hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol phun đều lên
bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vòng vài giây đến vài phút cho đến khi hiện màu [2], [4], [13].
2.3.2.4. Phƣơng pháp ác định cấu trúc
Cấu trúc hóa học của các hợp chất đƣợc thiết lập dựa vào các hằng số vật lý, các dữ kiện phổ cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu có liên quan.
a. Điểm nóng chảy (mp)
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Buchi B-545 tại Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Khoa học Huế.
b. Góc quay cực ([α]D)
Góc quay cực đƣợc đo trên máy Autopol III polarimeter tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm TT Huế.
c. Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại đƣợc đo trên máy FT-IR Prestige spectrometer (Shimadzu, Japan) tại Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Huế.
d. Phổ tử ngoại (UV)
Phổ tử ngoại đƣợc đo trên máy UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu, Japan) tại Khoa Hóa, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Huế.
e. Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối ion hóa hóa học ở áp suất khí
quyển (APCI-MS) đƣợc đo trên máy Agilent 6310 Ion Trap và máy Waters Xevo
TQ Mass Spectrometer tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
27
f. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai
chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
28
Chƣơng 3
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 3.1.1. Đặc điểm hình thái: 3.1.1. Đặc điểm hình thái:
Cây leo, thân dài hóa gỗ, từ 15-20 m. Thân nhẵn, màu hơi ngả trắng khi khô. Lá mọc đối dạng bầu dục dài, nhẵn cả 2 mặt, dài 15-22 cm, rộng 5-8 cm, gốc lá nhọn hay gần tù, đầu lá tù, thu hẹp thành mũi nhọn. Cuống lá dài 10-15 mm, nhẵn. Cụm hoa màu trắng ở nách lá, kiểu xim kép. Lá đài dài 0,8-1 mm, rộng 0,4-0,5 mm, dạng tam giác dài nhọn đầu, mặt ngoài có lông rõ, gốc đài có 5 tuyến nhỏ nhọn, mọc xen với lá đài. Ống tràng dài 1-2,5 mm, dạng ống thu hẹp ở đáy, ngoài nhẵn, trong có lông màu trắng. Cánh tràng dài 2,5-4 mm, rộng 1-1,2 mm, hình lƣỡi dài, mặt ngoài nhẵn, mặt trong có lông rõ ở một nửa phía phải. Nhị đính ở đáy ống tràng, chỉ nhị rất ngắn, dài 0,2 mm, nhẵn. Bao phấn dài 0,6-0,7 mm. Vòi nhụy dài 0,2 mm, nhẵn. Quả gồm 2 đại, mỗi đại dài 12-13 cm, chỗ rộng nhất 1,5-2 cm, đầu nhọn, gốc to không có cuống, mặt ngoài nhẵn. Hạt dài 15-20 mm, rộng 6-9 mm, hình trứng bị ép, đầu kéo dài thành mỏ (cán) mang chùm lông dài 6-8 cm, vỏ hạt nhẵn.
29
Hình 3.1. Cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Roxb. ) A. DC.
Chú thích: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Phần trên mặt đất c. Đại bổ đôi
b. Lá và quả d. Hạt mang chùm lông
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu cành
Mặt cắt ngang cành hình gần tròn. Ở cành non, biểu bì gồm 1 lớp tế bào xếp đều đặn, mặt ngoài có lớp cutin mỏng, dƣới biểu bì là mô dày. Ở cành già có lớp bần gồm hai hàng tế bào. Mô mềm vỏ là những tế bào hình đa giác hoặc bầu dục không đều nhau. Trong mô mềm vỏ, các tinh thể canxi oxalat hình khối và hình cầu gai nằm rải rác. Tế bào mô cứng đứng riêng lẽ hay tập trung thành đám, có kích thƣớc to, vách dày nằm xen với mô mềm vỏ. Từng đám sợi là những tế bào có thành dày khoang hẹp. Libe là những tế bào đa giác nhỏ. Gỗ liên tục, chiếm phần lớn diện tích vi phẫu, mạch gỗ hình tròn hoặc đa giác tròn, xếp thành dãy từ 2-5 mạch. Điểm đặc trƣng, libe xếp thành vòng quanh tủy. Mô mềm tủy là những tế bào hình tròn.
a b
30
Hình 3.2. Vi phẫu cành cây Tốc thằng cáng
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu gân lá cây Tốc thằng cáng
Gân lá hai mặt lồi, lồi rõ ở mặt dƣới, hơi lồi ở mặt trên. Từ ngoài vào trong có: biểu bì trên và biểu bì dƣới đều gồm một lớp tế bào kích thƣớc nhỏ, xếp đều đặn. Biểu bì dƣới mang nhiều lông che chở đa bào, mỗi lông gồm 2-4 tế bào. Dƣới biểu