3.1.1. Đặc điểm hình thái:
Cây leo, thân dài hóa gỗ, từ 15-20 m. Thân nhẵn, màu hơi ngả trắng khi khô. Lá mọc đối dạng bầu dục dài, nhẵn cả 2 mặt, dài 15-22 cm, rộng 5-8 cm, gốc lá nhọn hay gần tù, đầu lá tù, thu hẹp thành mũi nhọn. Cuống lá dài 10-15 mm, nhẵn. Cụm hoa màu trắng ở nách lá, kiểu xim kép. Lá đài dài 0,8-1 mm, rộng 0,4-0,5 mm, dạng tam giác dài nhọn đầu, mặt ngoài có lông rõ, gốc đài có 5 tuyến nhỏ nhọn, mọc xen với lá đài. Ống tràng dài 1-2,5 mm, dạng ống thu hẹp ở đáy, ngoài nhẵn, trong có lông màu trắng. Cánh tràng dài 2,5-4 mm, rộng 1-1,2 mm, hình lƣỡi dài, mặt ngoài nhẵn, mặt trong có lông rõ ở một nửa phía phải. Nhị đính ở đáy ống tràng, chỉ nhị rất ngắn, dài 0,2 mm, nhẵn. Bao phấn dài 0,6-0,7 mm. Vòi nhụy dài 0,2 mm, nhẵn. Quả gồm 2 đại, mỗi đại dài 12-13 cm, chỗ rộng nhất 1,5-2 cm, đầu nhọn, gốc to không có cuống, mặt ngoài nhẵn. Hạt dài 15-20 mm, rộng 6-9 mm, hình trứng bị ép, đầu kéo dài thành mỏ (cán) mang chùm lông dài 6-8 cm, vỏ hạt nhẵn.
29
Hình 3.1. Cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Roxb. ) A. DC.
Chú thích:
a. Phần trên mặt đất c. Đại bổ đôi
b. Lá và quả d. Hạt mang chùm lông
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu cành
Mặt cắt ngang cành hình gần tròn. Ở cành non, biểu bì gồm 1 lớp tế bào xếp đều đặn, mặt ngoài có lớp cutin mỏng, dƣới biểu bì là mô dày. Ở cành già có lớp bần gồm hai hàng tế bào. Mô mềm vỏ là những tế bào hình đa giác hoặc bầu dục không đều nhau. Trong mô mềm vỏ, các tinh thể canxi oxalat hình khối và hình cầu gai nằm rải rác. Tế bào mô cứng đứng riêng lẽ hay tập trung thành đám, có kích thƣớc to, vách dày nằm xen với mô mềm vỏ. Từng đám sợi là những tế bào có thành dày khoang hẹp. Libe là những tế bào đa giác nhỏ. Gỗ liên tục, chiếm phần lớn diện tích vi phẫu, mạch gỗ hình tròn hoặc đa giác tròn, xếp thành dãy từ 2-5 mạch. Điểm đặc trƣng, libe xếp thành vòng quanh tủy. Mô mềm tủy là những tế bào hình tròn.
a b
30
Hình 3.2. Vi phẫu cành cây Tốc thằng cáng
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu gân lá cây Tốc thằng cáng
Gân lá hai mặt lồi, lồi rõ ở mặt dƣới, hơi lồi ở mặt trên. Từ ngoài vào trong có: biểu bì trên và biểu bì dƣới đều gồm một lớp tế bào kích thƣớc nhỏ, xếp đều đặn. Biểu bì dƣới mang nhiều lông che chở đa bào, mỗi lông gồm 2-4 tế bào. Dƣới biểu bì là mô dày. Mô mềm cấu tạo bởi những tế bào vách mỏng, hình tròn, kích thƣớc không đều nhau, rải rác có các tinh thể canxi oxalat hình khối hay cầu gai. Hệ thống dẫn hình cung, gồm những đám libe với tế bào đa giác có kích thƣớc nhỏ xếp thành 2 cung bao bọc lấy cung gỗ. Mạch gỗ xếp đều đặn, liền nhau thành từng dãy từ 3-8 mạch. Ở phía trung tâm của gân lá giáp với cung libe-gỗ có nhiều đám sợi thành rất dày khoang hẹp.
Chú thích:
1. Bần 2. Mô mềm vỏ 3. Tế bào cứng 4. Đám sợi 5,7,9. Libe 6. Gỗ
8. Mô mềm tủy 10. Tinh thể canxi oxalat hình khối
11. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai
11 10
31
Hình 3.3. Vi phẫu gân lá cây Tốc thằng cáng
Chú thích
1. Mô dày 5,7. Libe 2. Biểu bì trên 6. Gỗ
3. Đám sợi 8. Lông che chở đa bào 4. Tinh thể canxi oxalat 9. Biểu bì dưới
32
3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu phiến lá
Biểu bì trên và biểu bì dƣới là các tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, có thành mỏng. Biểu bì dƣới có lông che chở đa bào và nhiều lỗ khí. Mô khuyết là các tế bào
vách mỏng, hình dạng thay đổi, kích thƣớc không đều, xếp chừa khuyết lớn. Tinh
thể canxi oxalat hình cầu gai nằm rải rác.
Hình 3.4. Vi phẫu phiến lá cây Tốc thằng cáng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích:
1. Biểu bì trên 4. Biểu bì dưới
2. Tinh thể canxi oxalat 5. Lông che chở đa bào 3. Mô khuyết 6. Lỗ khí
3.1.3. Đặc điểm bột cây
3.1.3.1. Đặc điểm bột thân, cành cây Tốc thằng cáng
Bột có màu vàng nâu, vị đắng. Soi dƣới kính hiển vi thấy có rất nhiều tinh bột. Hạt tinh bột đơn hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thƣớc từ 0,01-0,03 mm, thƣờng gặp ở dạng hạt kép, hạt ba và hạt bốn. Có nhiều tế bào cứng vách dày, khoang hẹp nằm riêng lẻ hoặc tập trung thành cụm. Mảnh mô mềm gồm những tế bào hình bầu dục, vách mỏng, thƣờng gặp mảnh mô mềm chứa tinh bột. Tinh thể canxi oxalat hình khối và hình cầu gai, kích thƣớc từ 0,03-0,06 mm. Sợi nằm rải rác hoặc tập trung thành bó sợi. Mảnh mạch.
6
33
Hình 3.5. Đặc điểm bột thân, cành Tốc thằng cáng
Chú thích
1. Tinh thể canxi oxalat hình khối 2. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai 3. Hạt tinh bột 4. Mảnh mô mềm 5. Mảnh mô mềm mang hạt tinh bột 6. Bó sợi 7. Đám tế bào cứng 8,9 Mảnh mạch
3.1.3.2. Đặc điểm bột lá cây Tốc thằng cáng
Bột có màu nâu, vị đắng. Soi dƣới kính hiển vi thấy các mảnh biểu bì trên có vách mỏng, hình đa giác. Mảnh biểu bì dƣới có vách hơi uốn lƣợn, mang lỗ khí. Lỗ khí có kích thƣớc từ 0,05-0,07 mm. Tinh thể canxi oxalat hình khối và hình cầu gai kích thƣớc 0,03-0,06 mm. Hạt tinh bột đơn rất ít, với kích thƣớc 0,01-0,02 mm. Sợi dài, thƣờng tập trung thành bó sợi, hiếm khi gặp riêng lẻ. Lông che chở đa bào, mảnh mạch.
1 2 3
4 5 6
7 8 9
34
Hình 3.6. Đặc điểm bột lá cây Tốc thằng cáng
Chú thích:
1. Tinh thể canxi oxalat hình khối
4. Lỗ khí 8. Lông che chở đa bào
2. Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai
5,6. Biểu bì dưới mang lỗ khí
9. Bó sợi 3. Hạt tinh bột 7. Biểu bì trên 10, 11, 12. Mảnh mạch
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0.1 mm 12
35
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3.2.1. Định tính các nhóm chất chính trong cây Tốc thằng cáng 3.2.1. Định tính các nhóm chất chính trong cây Tốc thằng cáng
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Tốc thằng cáng bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng, đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Alcaloid Mayer + Có Dragendorff + Bouchadat + 2 Flavonoid Cyanidin +++ Có NH3 +++ NaOH +++ FeCl3 5% +++ 3 Glycosid tim Liebermann ++ Có Baljet + Legal + Keller-Kiliani + 4 Coumarin Mở đóng vòng lacton - Không Diazo -
5 Saponin Hiện tƣợng tạo bọt - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Không
Salkowski -
6 Anthranoid Borntraeger - Không
7 Tanin FeCl3 5% + Có Chì acetate + Gelatin 1% + 8 Acid carboxylic Na2CO3 +++ Có 9 Đƣờng khử Fehling ++ Có
10 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy + Có
11 Acid amin Ninhydrin 3% - Không
12 Steroid Liebermann ++ Có
Ghi chú:
(-): Phản ứng âm tính (++): Phản ứng dương tính rõ (+): Phản ứng dương tính (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Nhận ét: Qua các phản ứng định tính hóa học đặc trƣng đã xác định trong phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng có alcaloid, flavonoid, glycosid tim, acid carboxylic, steroid, tanin, đƣờng khử và chất béo. Trong đó flavonoid, glycosid tim và steroid là 3 nhóm chính cho phản ứng dƣơng tính rõ.
36
3.2.2. Quá trình chiết uất 3.2.2.1. Xử lý mẫu
Sau khi thu mẫu, phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng đƣợc loại bỏ phần hƣ hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50 - 60 C, xay thành bột mịn. Lƣợng bột mịn đem chiết xuất là 2,5 kg.
3.2.2.2. Chiết xuất cao toàn phần
Toàn bộ lƣợng bột thô Tốc thằng cáng đƣợc cho vào bình chiết và làm ẩm bằng methanol, đậy kín và để yên cho đến khi toàn bộ lƣợng bột thấm đều dung môi và trƣơng nở hoàn toàn. Sau đó thêm methanol vừa đủ ngập dƣợc liệu, cách bề mặt dƣợc liệu khoảng 3 cm, để ngâm ở nhiệt độ phòng. Tiến hành chiết 3 đợt, mỗi đợt chiết trong 05 ngày với 10 lít methanol. Dịch chiết thu đƣợc đem thu hồi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc cao chiết methanol (105 g).
3.2.2.3. Chiết xuất các phân đoạn
Phân tán cao toàn phần vào khoảng 3 lít nƣớc cất rồi chiết phân bố lần lƣợt với
các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane (2 lít × 3 lần), chloroform (2 lít ×
3 lần), ethyl acetate (2 lít × 3 lần). Sau khi để phân lớp hoàn toàn, gạn riêng phần dung môi hữu cơ và cô quay dƣới áp suất thấp thu đƣợc cao chiết tƣơng ứng với mỗi loại dung môi, ký hiệu lần lƣợt là APH (32 g), APC (18 g), APE (10 g) và APW (27 g) là cao phần nƣớc còn lại. Quá trình chiết xuất đƣợc mô tả ở hình 3.7.
37
Hình 3.7. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây Tốc thằng cáng
Cao phân đoạn n-hexane, chloroform, ethyl acetate và phân đoạn nƣớc đƣợc
tiến hành phân lập trên các loại sắc ký cột. Trong đó, phân đoạn chloroform phân lập đƣợc 2 hợp chất và phân đoạn nƣớc phân lập đƣợc 3 hợp chất.
3.2.3. Quá trình phân lập các hợp chất từ cây Tốc thằng cáng
3.2.3.1. Quá trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn chloroform
Toàn bộ cao phân đoạn APC đƣợc hòa tan hoàn toàn vào lƣợng chloroform tối
thiểu và triển khai trên SKC pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải là n-hexane-
acetone (3:1, v/v) thu đƣợc 2 phân đoạn, APC1 APC2. Phân đoạn APC1 (10,2 g)
đƣợc khai triển bằng SKC pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải là chloroform- acetone (20:1, v/v). Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM, gom các phân đoạn
tƣơng tự với nhau, thu đƣợc 3 phân đoạn, APC1A APC1C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân đoạn APC1B (5,7 g) đƣợc phân tách bằng cột Sephadex LH-20 với hệ
dung môi methanol-nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc 2 phân đoạn kí hiệu là APC1B1
APC1B2. Phân đoạn APC1B1 (2,2 g) đƣợc triển khai bằng cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là methanol-nƣớc (15:1, v/v). Theo dõi quá trình rửa giải bằng
SKLM và gom các phân đoạn tƣơng tự nhau, thu đƣợc 2 phân đoạn, APC1B1A
Dịch nƣớc còn lại Ethyl acetate Chloroform n-hexane eeeeeeeênc nmnmvnm vnmv,bbV NbnBMN VBmncbv nmbjfbgjk beee Lắc phân đoạn Phân tán/nƣớc Cô quay to, áp suất thấp Ngâm to phòng/methanol
APH (32 g) APC (18 g) APE (10 g) APW (27 g)
Bột dƣợc liệu (2,5 kg)
Cao chiết methanol (105 g)
Dịch chiết/methanol
38
APC1B1B. Phân đoạn APC1B1A (1,8 g) tiếp tục tinh chế bằng SKC pha thƣờng, hệ
dung môi rửa giải là n-hexane-acetone (10:1, v/v, 300 ml) sau đó đổi thành (6:1,
v/v) cho đến khi quá trình rửa giải kết thúc, thu đƣợc hợp chất AP1 (156,5 mg) dƣới
dạng bột màu trắng.
Phân đoạn APC1A (750 mg) tiến hành triển khai bằng SKC pha thƣờng với hệ
dung môi n-hexane-chloroform-ethyl acetate (5:1:0,1, v/v/v, 300 ml) sau đó đổi
thành (3:1:0,1, v/v/v) cho đến khi quá trình rửa giải kết thúc. Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM và gom các phân đoạn tƣơng tự nhau thu đƣợc 2 phân đoạn ký
hiệu là APC1A1 APC1A2. Tiếp tục tinh chế phân đoạn APC1A1 (56 mg) bằng
cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là acetone-nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc hợp
chất AP2 (15,8 mg) dƣới dạng bột màu trắng.
Các bƣớc tiến hành phân lập hợp chất từ cao chiết chloroform đƣợc thể hiện ở hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất AP1 và AP2 từ phân đoạn chloroform.
n-hexane-chloroform-ethyl acetate (5:1:0,13:1:0,1, v/v/v) AP1 (156,5 mg) YMC RP-18 methanol-nƣớc (15:1, v/v) n-hexane-acetone (3:1, v/v) n-hexane-acetone (10:16:1, v/v) Sephadex LH-20 methanol 50% chloroform-acetone (20:1, v/v) APC1C YMC RP-18 acetone-nƣớc (1:1, v/v) APC1B1 APC2 APC APC1 APC1B APC1A APC1B1A APC1B1B AP2 (15,8 mg) APC1A2 APC1A1 APC1B2
39
3.2.3.2. Phân lập các hợp chất từ phân đoạn nƣớc
Cao chiết APW đƣợc tách bằng cột Diaion HP-20, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ dung môi methanol-nƣớc (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v). Theo dõi quá trình khai triển bằng SKLM, các phân đoạn có sắc ký đồ tƣơng tự nhau đƣợc gộp chung
thu đƣợc 3 phân đoạn, APW1 APW3. Phân đoạn APW1 (8,2 g) đƣợc tiến hành
phân lập trực tiếp trên cột YMC RP-18, rửa giải gradient bằng hệ dung môi
methanol - nƣớc (1:1, 1:2, v/v, mỗi hệ 1 lít) thu đƣợc 3 phân đoạn, APW1A
APW1C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Toàn bộ cao phân đoạn APW1A (1,05 g) đƣợc hòa tan hoàn toàn vào lƣợng tối thiểu methanol và triển khai trên sắc ký cột pha thƣờng, hệ dung môi rửa giải
chloroform-methanol-nƣớc (4:1:0,1, v/v/v) thu đƣợc 4 phân đoạn, APW1A1
APW1A4. Phân đoạn APW1A2 (95 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 với pha động là hệ dung môi methanol-nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc hợp chất
AP5 (20,5 mg) dƣới dạng bột màu vàng. Phân đoạn APW1A4 (117 mg) cũng đƣợc
tinh chế bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 với pha động là hệ dung môi methanol-
nƣớc (1:1, v/v) thu đƣợc hợp chất AP6 (38,6 mg) dƣới dạng bột màu vàng.
Toàn bộ cao phân đoạn APW3 (10,5 g) đƣợc hòa tan hoàn toàn vào lƣợng methanol tối thiểu và triển khai trên cột sắc ký lọc gel Sephadex LH-20. Dung môi rửa giải là methanol 100%. Theo dõi quá trình rửa giải bằng SKLM, các phân đoạn
tƣơng tự nhau đƣợc gộp chung, thu đƣợc 3 phân đoạn, APW3A APW3C. Phân
đoạn APW3C (4,7 g) sau khi khảo sát bằng SKLM đƣợc phân tích tiếp bằng sắc ký cột pha thƣờng, rửa giải gradient bằng hệ dung môi chloroform-methanol-nƣớc (5:1:0,1,
4:1:0,1, 3:1:0,1, v/v/v) thu đƣợc 3 phân đoạn, APW3C1 APW3C3. Kiểm tra bằng
SKLM cả 3 phân đoạn. Trên sắc ký đồ nhận thấy phân đoạn APW3C2 cho vết sắc ký tƣơng đối rõ và lẫn ít tạp, hơn nữa lƣợng cắn phân đoạn khá nhiều, do đó, phân đoạn này đƣợc ƣu tiên phân tích tiếp theo. Lƣợng cắn APW3C2 (132 mg) đƣợc hòa tan với một lƣợng tối thiểu methanol. Tiến hành kỹ thuật lọc rửa chất trong methanol, thu đƣợc hợp
40
Các bƣớc tiến hành phân lập các hợp chất từ cao chiết nƣớc đƣợc thể hiện ở hình 3.9
Hình 3.9. Sơ đồ phân lập hợp chất AP5, AP6 và AP9 từ cao chiết nước
3.2.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Tốc thằng cáng 3.2.4.1. Hợp chất AP1
Thể chất: Bột màu trắng, tan tốt trong CHCl3.
Nhiệt nóng chảy: 284–286 oC.
Góc quay cực: +65 (c 0,5, EtOH).
Phổ UV (MeOH) λmax (nm): 201, 230, 273.
Phổ IR (KBr) có các vân hấp thụ đặc trƣng của các nhóm chức phù hợp với cấu trúc hóa học của acid ursolic.
νmax (cm-1): 3433 (OH alcohol), 2870 (C=C), 1690 (C=O).
Phổ ESI-MS: m/z 479,2 [M+Na]+, 455,2 [M-H]- tƣơng ứng với khối lƣợng
phân tử là M = 456,7 g/mol.
Hợp chất AP1 kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi n-hexane-acetone (4:1,
YMC RP-18
methanol-nƣớc (1:1, 1:2, v/v)
APW1A APW1B APW1C
APW
APW1 APW2 APW3
Diaion HP-20 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
methanol-nƣớc (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v)
APW3A APW3B APW3C
Sephadex LH-20 methanol 100% chloroform-methanol-nƣớc (5:1:0,1, 4:1:0,1, 3:1:0,1, v/v/v) APW3C2 APW3C3 APW3C1 AP9 (45,0 mg) Sephadex LH-20 methanol 50% AP5 (20,5 mg) APW1A 3 APW1A4 APW1A1 APW1A2 chloroform-methanol-nƣớc (4:1:0,1, v/v/v) B2B1 AP6 (38,6 mg) Sephadex LH-20 methanol 50%
41
v/v), thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% /ethanol, xuất hiện một vết màu hồng, Rf =
0,32.
Phổ 1H-NMR đo trong CDCl3của hợp chất AP1 thể hiện tín hiệu của 5 nhóm
methyl bậc ba tại δH 0,78 s, 0,81 s, 0,93 s, 0,98 s, 1,09 s và 2 nhóm methyl bậc hai
tại δH 0,86 (d, J = 6,5 Hz), 0,95 (d, J = 6,0 Hz). Ngoài ra, tín hiệu 1 nhóm
oxymethine tại δH 3,20 (1H, dd, J = 10,0, 6,0 Hz, H-3) và 1 proton olefinic tại δH
5,24 (1H, br.s, H-12) cũng đƣợc ghi nhận. Căn cứ vào hằng số tƣơng tác của proton
thuộc nhóm oxymethine với 2 proton của nhóm methylene bên cạnh (J1 = Jae = 6,0
Hz, J2 = Jaa = 10,0 Hz) cho phép xác định định hƣớng axial của proton này trong
cấu dạng ghế của vòng A của khung triterpene. Nhƣ vậy, proton của nhóm
oxymethine phải có cấu hình α.
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất AP1 chỉ ra tín hiệu của 30 carbon gồm 7
nhóm methyl, 9 nhóm methylene, 7 nhóm methine và 7 carbon bậc bốn. Trong đó,
tín hiệu tại δC 180,8 (C-28) đƣợc gán cho nhóm carboxy (-COOH); tại δC 138,3 (C-
13) và 125,6 (C-12) đƣợc gán cho nối đôi 3 lần thế, tín hiệu tại δC 79,0 (C-3) thuộc
về nhóm oxymethine. Các dữ kiện phổ 1D-NMR (Bảng 3.2) cho phép dự đoán hợp
chất AP1 là một triterpene khung ursane, có công thức phân tử là C30H48O3 (M =
456 g/mol, DBE = 7) với 1 nối đôi, 1 nhóm COOH và 1 nhóm OH trong phân tử. Kết hợp với việc so sánh với hợp chất tham khảo ở tài liệu [30] (Bảng 3.2) cho phép