THẰNG CÁNG
1.3.1. Tác dụng sinh học chi Anodendron
Chi Anodendron là một chi lớn, có mặt ở nhiều nơi trên thế giới. Tuy vậy, số lƣợng các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi này còn rất ít. Năm 2014, các nhà hóa học Trung Quốc đã tiến hành phân lập và thử hoạt tính của các chất
phân lập đƣợc từ loài A. formicinum. Kết quả nghiên cứu cho thấy 4-hydroxy-3-
prenylbenzoic acid, 4-(O-β-glucopyranosyl)-3-prenylbenzoic acid và anodendrosin E có
hoạt tính ức chế chủng vi khuẩn Providensia smartii với các giá trị MIC bằng nhau là
17
mạnh đối với chủng Escherichia coli với giá trị MIC là 0,781 µg/mL, tƣơng đƣơng với
chất đối chiếu là gentamycin [64].
Hợp chất affinoside T phân lập từ loài A. affine cũngđƣợc tìm thấy trong loài
Elaeodendron orientale và đã đƣợc tiến hành thử hoạt tính trên một số dòng tế bào ung thƣ. Affinoside T ức chế các dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm: dòng tế bào HeLa (ung thƣ cổ tử cung), A-549 (ung thƣ phổi), MCF-7 (ung thƣ vú), HL-60 (ung
thƣ máu cấp tính) với các giá trị IC50 lần lƣợt 0,02; 0,02; 0,034 và 0,01 µM. Hoạt
tính này đƣợc đánh giá tƣơng đƣơng đến mạnh hơn so với chất đối chiếu đƣợc sử dụng trong cùng thí nghiệm là digoxin và digitoxigenin. Đặc biệt, tác dụng của Affinoside T trên dòng tế bào MCF-7 mạnh gấp 4 lần so với digoxin, gấp 29 lần so với digitoxigenin và có độ chọn lọc cao hơn so với chất đối chiếu [62].
Ngoài ra, các hợp chất phân lập đƣợc từ loài A. affine nhƣ affinoside A, 4,5-
dehydro-12-oxo-affinoside E và affinoside M đều cho thấy khả năng ức chế sự phát
triển ấu trùng loài tằm bƣớm Bombyx mori với các giá trị ED50 lần luợt là 1,0; 3,0
và 7,5 µg/ml [38].
1.3.2. Tác dụng sinh học của cây Tốc thằng cáng
Ghi nhận của Võ Văn Chi (1997) trong Từ điển cây thuốc Việt Nam [3], ở Ấn Độ, rễ Tốc thằng cáng có các tính chất tƣơng tự tính chất của alcaloid Ipeca có
trong loài (Cephaelis ipecacuanha (Brot.) A. Rich.) nhƣ kích thích mạnh niêm mạc
và da. Do đó, rễ cây đƣợc dùng làm thuốc gây nôn và trị ho.
Tài liệu nghiên cứu cây thuốc bản địa của Pankaj Oudhia, loài Anodendron
paniculatum (Roxb.) A. DC. đƣợc Y học cổ truyền Ấn Độ xếp vào đông dƣợc chữa các bệnh hầu họng và miệng, cụ thể là chữa khó thở, khó nuốt, gây nôn, chỉ ho. Liều dùng với rễ và vỏ cây khô khoảng 5g/ngày, dùng riêng, không phối hợp với
các thuốc khác. Ngoài ra, ở Ấn Độ ngƣời ta còn dùng loài này trong các phƣơng
thuốc phối hợp điều trị biến chứng tiểu đƣờng, teo tinh hoàn ở nam giới, các bệnh
phù (họng, phổi và tim), chữa rối loạn thần kinh [86].
Đề tài “Nghiên cứu các cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Miền Trung theo hƣớng tác dụng chống oxy hoá, diệt tế bào ung thƣ” (Đề tài cấp Bộ GD & ĐT,
18
paniculatum (Roxb.) A. DC.) là một trong những cây thuốc mà các thầy thuốc bản địa ở vùng đồng bào Pako - Vân Kiều ở Quảng Trị sử dụng để chữa các bệnh liên
quan đến khối u [7]. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro cho thấy dịch
chiết methanol tổng của phần trên mặt đất cây Tốc thằng cáng thể hiện hoạt tính ức chế 5 trên 6 dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm, đó là các dòng tế bào LU-1 (ung thƣ phổi ngƣời), Hep G2 (ung thƣ gan ngƣời), KB (ung thƣ biểu mô), SW-480 (ung thƣ
ruột kết) và MKN7 (ung thƣ dạ dày) với các giá trị IC50 lần lƣợt là: 14,24; 11,78;
19
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng. Cây đƣợc thu hái tại huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 06 năm 2014. Tên khoa học
đƣợc xác định là Anodendron paniculatum (Roxb.) A. DC., họ Trúc đào -
Apocynaceae. Mẫu tiêu bản (DK-01) đƣợc lƣu giữ tại Bộ môn Thực vật Dƣợc - Khoa Dƣợc - Trƣờng Đại học Y Dƣợc Huế.
Mẫu nguyên liệu sau khi thu hái đƣợc rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50- 60 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng.
Hình 2.1. Phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng
2.2. VẬT LIỆU 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
Dung môi đƣợc sử dụng bao gồm methanol, ethanol, n-butanol, ethyl acetate,
chloroform, n-hexane, acetone, acid formic, amoniac, nƣớc cất 2 lần, acid acetic,
javel, xanh methylene, đỏ carmine, glycerin.
Thuốc thử đƣợc sử dụng gồm có: dung dịch H2SO4 10% pha trong ethanol,
20
Chất nhồi cột sắc ký: silica gel pha thƣờng (Silica gel 60, 0,040-0,063 mm (230-400 mesh ASTM), Merck) và pha đảo (YMC, 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20, Diaion HP-20.
Bản sắc ký lớp mỏng pha thƣờng (TLC-Silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo
(RP-18 F254, Merck).
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dƣợc Điển Việt Nam IV.
2.2.2. Máy móc - thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, đũa thủy tinh, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình tam giác, bình gạn, bình chạy sắc ký, pipette v.v...
Kính hiển vi quang học, cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204–S, độ
chính xác 0,0001 g. Micropipette 100, 200, 500 µl (Human), micropipette 50 µl
(Excel monopette 8000). Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không.
Máy đo điểm nóng chảy Buchi B-545 (BÜCHI Labortechnik AG, Switzerland).
Máy đo góc quay cực ([α]D) Autopol III polarimeter (Rudolph, USA).
Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Prestige spectrometer (Shimadzu, Japan). Máy đo phổ tử ngoại UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu, Japan).
Máy đo phổ khối lƣợng Agilent 6310 Ion Trap và máy Waters Xevo TQ Mass
Spectrometer.
Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật
- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật của cây tại thực địa. Thu hái,
làm tiêu bản và lƣu giữ tiêu bản.
- Xác định tên khoa học của cây nghiên cứu trên cơ sở phân tích đặc điểm
21
thực vật [3], [6], [10] cùng với sự hỗ trợ của nhà khoa học chuyên ngành thực vật học.
- Nghiên cứu các đặc điểm vi học:
Vi phẫu cành và lá của cây Tốc thằng cáng
Phƣơng pháp làm tiêu bản tạm thời [15]:
Dƣợc liệu khô đƣợc ngâm mềm, cắt ngang thành lát cắt mỏng. Sau đó tiến hành ngâm nƣớc Javen 30 phút để tẩy các chất trong các tế bào. Tiếp tục rửa với nƣớc nhiều lần, rồi với acid acetic và cuối cùng đƣợc rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm vi phẫu thu đƣợc bằng xanh methylene trong khoảng thời gian 15-30 giây và nhanh chóng rửa lại bằng nƣớc. Đỏ carmine đƣợc sử dụng cho lần nhuộm tiếp theo trong khoảng 30 phút. Tiêu bản sau nhuộm đƣợc rửa lại với nƣớc. Đặt vi phẫu vào một giọt glycerin trên phiến kính, đậy lá kính. Sau đó, tiến hành soi tiêu bản dƣới kính hiển vi quang học, chụp ảnh và mô tả các đặc điểm của vi phẫu.
Soi bột thân và lá của cây Tốc thằng cáng
Dƣợc liệu sau khi thu hái đƣợc sấy khô, nghiền mịn thành bột, rây cho bột có kích thƣớc thích hợp. Tiếp theo, bột dƣợc liệu đƣợc đặt lên trên phiến kính có sẵn giọt nƣớc cất, đậy lá kính và quan sát các đặc điểm dƣới kính hiển vi quang học. Tiến hành chụp ảnh và mô tả các đặc điểm bột dƣợc liệu [15].
2.3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.3.2.1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dƣợc liệu
Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phƣơng pháp sàng lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong cây bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng [1], [4].
- Định tính alcaloid: Cho khoảng 5g dƣợc liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dƣợc liệu bằng dung dịch NH4OH 6N. Sau 30 phút, thêm chloroform ngập dƣợc liệu, lắc, đậy kín. Ngâm 12h, gạn dịch chloroform vào bình gạn, lắc kỹ với
dung dịch H2SO4 1N, gạn lấy dịch chiết acid để làm các phản ứng. Cho 1ml dịch
chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử lần lƣợt:
+ Thuốc thử Dragendorff: cho tủa màu da cam. + Thuốc thử Mayer: cho tủa trắng.
22
- Định tính flavonoid: Lấy khoảng 1g dƣợc liệu cho vào ống nghiệm, thêm cồn
90o, đun sôi cách thủy vài phút. Lọc nóng, dịch lọc để làm các phản ứng định tính:
+ Phản ứng Cyanidin (phản ứng khử hóa): Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đặc rồi đun nóng cách thủy, khoảng vài phút sau xuất hiện màu hồng hơi tím.
+ Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết,
thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện tủa màu xanh nâu.
+ Phản ứng với kiềm:
Phản ứng với NH3: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô rồi hơ lên lọ
NH3 đặc, thấy màu vàng đậm hơn lên. Phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt NaOH 10%
- Định tính glycosid tim: Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 10g dƣợc
liệu, thêm 50ml cồn 25o, ngâm 24 giờ. Gạn lấy dịch chiết. Loại tạp bằng dung dịch
chì acetat 30% dƣ. Loại chì acetat thừa bằng Na2SO4 bão hòa, đến khi không còn
tủa với Na2SO4 nữa. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ 3 lần với chloroform,
mỗi lần 20ml. Gạn lấy dịch chloroform cho vào cốc thủy tinh, loại nƣớc bằng cách lọc qua bông. Dịch chiết trong, không lẫn nƣớc. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm, đem cô cách thủy đến khô. Cắn thu đƣợc để làm phản ứng định tính glycosid tim.
+ Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, thêm vài giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1% và vài giọt dung dịch NaOH 10%, lắc, thấy xuất hiện màu hồng. Phản ứng dƣơng tính.
+ Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet, thấy xuất hiện màu đỏ da cam. Phản ứng dƣơng tính.
+ Phản ứng Liebermann: Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic. Đặt
nghiêng ống nghiệm 45o
, cho thêm đồng lƣợng acid sulfuric đặc theo thành ống để dịch lọc trong ống nghiệm đƣợc chia thành 2 lớp. Giữa 2 lớp xuất hiện vòng tím đỏ.
+ Phản ứng Keller-Kiliani: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol
23
Nghiêng ống nghiệm 45o, thêm từ từ vào thành ống nghiệm 0,5ml acid H2SO4 đặc,
tránh xáo trộn lòng ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai chất lỏng xuất hiện một vòng màu nâu đỏ.
- Định tính coumarin: Chiết xuất coumarin bằng cồn 96o, lọc, dịch lọc để làm các phản ứng:
+ Phản ứng mở - đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết. Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% vào ống 1, ống thứ 2 để nguyên. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm đến sôi, quan sát hiện tƣợng. Tiếp tục để nguội rồi thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml nƣớc cất. Lắc đều, quan sát quá trình:
Ống 1: có tủa đục màu vàng → trong suốt. Ống 2: trong → có tủa đục.
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, thấy có tủa đục nhƣ ống 2.
+ Phản ứng diazo hóa: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Đun sôi cách thủy vài phút. Lấy ra để nguội rồi cho thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Diazo mới pha, thấy xuất hiện màu đỏ.
- Định tính Saponin: Cho 5g dƣợc liệu vào bình nón 100ml, chiết bằng 30ml
cồn 900, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp. Dịch chiết cồn để làm phản ứng:
+ Quan sát hiện tƣợng tạo bọt: Cho vài giọt dịch chiết vào ống nghiệm có 5ml nƣớc, lắc mạnh trong 2 phút, cột bọt cao bền trong 15 phút.
+ Phản ứng Salkowski: Dịch lọc cho vào ống nghiệm. Để nghiêng ống
nghiệm 45o
, cho từ từ vào thành ống nghiệm 1-2 giọt acid H2SO4 đậm đặc, thấy
xuất hiện màu tím hồng.
- Định tính anthranoid: Lấy khoảng 3g dƣợc liệu cho vào bình nón dung tích
100ml, thêm 50ml dung dịch H2SO4 10%. Đun sôi trực tiếp 15 phút. Lọc nóng vào
bình gạn, để nguội, lắc với 5ml chloroform. Gạn lớp chloroform để làm phản ứng Bortraeger. Cho 1ml dịch chloroform vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc kỹ, thấy xuất hiện màu tím đỏ. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính tanin: Cho khoảng 1g dƣợc liệu vào ống nghiệm, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi trực tiếp vài phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc làm các phản ứng sau:
24
+ Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng.
+ Phản ứng với dung dịch Chì acetate 10%, xuất hiện tủa bông.
+ Phản ứng với FeCl3 5%: Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm một vài
giọt dung dịch FeCl3, xuất hiện tủa xanh đen.
- Định tính acid carboxylic: Cho bột dƣợc liệu vào ống nghiệm, thêm nƣớc
cất, đun sôi trong vài phút, để nguội, lọc. Thêm vào dịch lọc 1 ít bột Na2CO3 thấy
có bọt khí CO2.
- Định tính đường khử: Cho 2g bột dƣợc liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi cách thủy vài phút, lọc lấy dịch. Cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A + 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun sôi cách
thủy 10 phút,xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính chất béo: Cân khoảng 10g dƣợc liệu cho vào túi lọc đã chuẩn bị sẵn rồi cho vào bình chiết Shoxhlet, chiết hồi lƣu với dung môi là ether dầu hỏa trong 3 giờ, thu đƣợc dịch lọc. Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy trắng, hơ nóng giấy lọc trên bếp điện, vết mờ còn lại trên giấy. Phản ứng dƣơng tính.
- Định tính acid amin: Cho khoảng 2g dƣợc liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nƣớc cất, đun sôi cách thủy 5 phút, lọc nóng. Lấy 2ml dịch lọc vào ống nghiệm khác, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi vài phút, xuất hiện màu tím.
- Định tính steroid: Bằng phản ứng Liebermann.
2.3.2.2. Phƣơng pháp chiết xuất
a. Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần
Dịch chiết toàn phần thu đƣợc bằng cách sử dụng methanol làm dung môi chiết xuất. Bột dƣợc liệu đƣợc ngâm trong methanol ở nhiệt độ phòng, mỗi đợt chiết kéo dài trong vòng 05 ngày sau đó thay methanol mới và tiến hành đợt chiết tiếp theo. Kết thúc 3 đợt chiết, dịch chiết đƣợc gộp lại và đƣợc tiến hành bốc hơi dung môi dƣới áp suất thấp thu đƣợc cao toàn phần [2], [4], [16].
25
Phƣơng pháp chiết xuất phân đoạn thực hiện bằng bình gạn thủy tinh. Phân tán cao toàn phần trong nƣớc. Tiến hành lắc phân đoạn với các dung môi hữu cơ có độ
phân cực tăng dần: n-hexane, chloroform, ethyl acetate trong bình gạn, thu đƣợc lần
lƣợt các phân đoạn n-hexane, chloroform, ethyl acetate và phần nƣớc còn lại. Bốc
hơi dung môi trong máy cô quay thu đƣợc cao cắn tƣơng ứng của từng phân đoạn [2], [4], [16].
2.3.2.3. Phƣơng pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phƣơng pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ, cột trao đổi ion và cột lọc qua gel. Phƣơng pháp nhồi cột ƣớt đƣợc sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột [2], [4], [13]. Sắc ký lớp mỏng đƣợc sử dụng để theo dõi quá trình rửa giải.
a. Sắc ký cột hấp phụ
- Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn đƣợc nhồi trong cột thủy tinh. Nhờ vậy mà có thể triển khai liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay