này sẽ để lại ADN và thối hố tất cả protein cũng như các nucleotiđ. Sau đĩ các phiến kính được đưa vào dung dịch kiềm trước khi điện di. Các chuỗi sicu xoắn của ADN cĩ thể kháng cự lại sự điện đi. Tuy nhiên, các đoạn gẫy của ADN thì bị nới lỏng cấu trúc siêu xoắn và sau đĩ di chuyển tự do. Chúng tạo thành một cái "đuơi" cho đến "đẩu" nucleotỉđ (do đĩ tạo hình dạng "sao chổi"). Vầ tỷ ỉệ % ẦND đi chuyển vầo phần đuơi phan ấnh số lượng tần suất đoạn gẫy ADN, thường trên một khoảng từ một vài trăm đoạn gầy/ tế bào đến vài nghìn.
2.2.42- Định lượng trực tiếp 8-oxo-deoxyguanosỉn trong ADN bằng HPLC
[18] [21] [22] [23] [24] [25]
Một phương pháp nữa để định lượng tổn thương ADN oxy hố là định lượng trực tiếp 8-oxo-deoxyguanosin trong ADN đã bị thuỷ phân bằng cách sử dụng phương pháp HPLC phát hiện bằng detcctor điện hố, hoặc phân tích 8- oxo-guanin với phương pháp GC-MS. Lây các mầu bạch càu từ 36 cá thể tương dồng và cùng thử với phương pháp điện di gel dơn tế bào; sử dụng phương pháp để giảm thiểu sự oxy hố trong quá trình bào chế kết quả là với phương pháp HPLC nồng độ 8-oxo-đeoxyguanosin khống trên 10.000/ tế bào.
2.2.5- Đo hoạt tính enzyme supeoxid dismutase (SOD) [14]
SOD là một enzymc xúc tác cho phản ứng loại bỏ gốc tự do superoxid: 02- + Oj + 2H H202 + 02 (1)
Hằng sộ' tốc độ của phản ứng này rất lớn (k= 109 M/s), nên nồng độ gốc
nghĩa khả nâng loại bỏ gốc * 02 mạnh và suy ra lượng gốc ’ 02' cĩ trong tế bào thấp.
Thơng thường để xác định hoạt tính cnzyme SOD, người ta dùng hệ
(XH) và xanthinoxyđâSê (XO) để tạo râ gốc 02"f gốc này phản ứng
nhanh với chất INT [2(4-iodophcnyl)-3(4-nitrophenol)-5-phenyltetrazolium chloriđe], tạo ra một phẩm màu đỏ fịrmazan. Khi cĩ SOD thì gốc *02' bị phản huỷ, sẽ ức chê sự hình thành màu đỏ formazan này. Dựa vào phần trăm ức chế suy ra hoạt độ enzyme SOD.
2.2.6- Đo các chất chốngperoxide GSH vổ GSỈỊPx [14] [291 [32]
Trong hệ thống chống peroxide cĩ hai chất chống oxy hố quan trọng là GSH và GSHPx. Cĩ nhiều phương pháp xác định hai hợp chất trên như chuẩn độ ampc kế, cực phổ...nhtmg đặc hiệu và nhạy nhất là nhũng phương pháp được giới thiệu dưới đây
2.2.6. ỉ -Xác định GSHPx theo phương pháp do quang của H.V.Bergmeyer
Người ta dựa vào sụ biến thiên độ hấp thụ quang học (AE) trong thời gian 1 phút, khi cơ chất và sản phẩm chuyển hố của nĩ cĩ sự khác nhau về độ hấp thụ quang học ỏ một hước sĩng Ả nhất định nào đĩ. Khi cơ chất và sản phẩm chuyển hố khơng cĩ sự khác nhau vê mạt độ quang học này, nhưng sản phẩm chuyển hố tiếp theo hoặc tiền chất của nĩ cĩ sự khác nhau về mật độ quang học, thì hoạt độ enzym cĩ thể xác định được bằng cách ghcp hai phản ứng, chọ chúng xảy ra Irong cùng một cốc đo, yớị Ịựợng dự tiền chấỊ và Ịựựng dư enzym xúc tác cho pư chuyển hố phụ trợ. Khí đĩ, tốc đơ chuyển hố cơ chất của enzym cần nghiên cứu sẽ phụ thuộc vào lượng enzym cĩ trong dịch thử. Bằng cách theo dõi mật đơ quang ở một bước sĩng đã chọn, ta biết lượng
ứng bằng phương pháp đo quang ở Ằ- 340 nm , với chỉ thị quang học !à NADPH2 và enzym phụ trợ glutathion reduclase (GR) theo sơ đồ phản ứng:
2GSH + ROOH GSSG + H2Ơ + ROH
GSSG + NADPHZgr»- 2GSH + NADP
Việc xác định hoạt độ enzym Ố đây dựa trên nguyên tắc xác tlịnh hoạt độ enzym bằng phương pháp đo quang cùa H.V.Bergmeyer. Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa t (phút) và E (mệt độ quang), bỉến thiên ÀE được theo dõi trước khi phản ứng bắt đẩu (khi cho thành phần cuối cùng của hỗn hạp phản ứng vào cuvet đo) và sau đĩ khoảng từ 3 đến 5 phút. Dựa vào đồ thị thu được, tính ra AE/phút. Từ đổ suy ra hoạt độ cn/ym.
2.2.62- Xác định GSHPx theo phương pháp của Paglia và Vưlentine:
Nguyền tắc của phương pháp là glutathion peroxidase xúc tác phản ứng