Tái tổ hợp tương đồng trong một genome là sự kiện sinh lý quan trọng xảy ra trong các trường hợp khác nhau. Sự sắp xếp lại genome tạo ra các gen globulin miễn dịch hoạt động chức năng là một ví dụ. Thật là quan trọng để sắp xếp lại genome ở các vị trí mà không thể tiến hành một cách tự nhiên với một phương thức kiểm soát.
Sự chọn lọc dương tính và âm tính kép để tách chiết tế bào mà tái tổ hợp tương đồng xảy ra
A. Tái tổ hợp tương đồng bao hàm sự hợp nhất của gen neor và loại đi gen TK. Các tế bào này là kháng với G418 và gancyclovir.
B. Sau sự hợp nhất của vector vào một vị trí ngẫu nhiên, các tế bào kháng với G418 nhưng nhạy cảm với gancyclovir
Hai hệ thống không phát hiện thấy trong giới động vật đã được bổ sung để thực hiện điều này. Một hệ thống có nguồn gốc từ bacteriophage P1. Genome này chứa các trình tự LoxP với kích thước 34 bp, có khả năng tái kết hợp và mang tính đặc hiệu cao chỉ khi có mặt enzyme recombinase của phage Cre. Hệ thống thứ hai là tương tự một cách cơ bản nhưng có nguồn gốc khởi đầu từ nấm men. Trình tự FRT tái kết hợp với hiệu quả cao và mang tính đặc hiệu khi có mặt enzyme recombinase Flp. Hệ thống Cre-LoxP là phổ biến nhất và được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau (Nagy, 2000). Các thể đột biến khác nhau của các trình tự LoxP, FRT đang được sử dụng để điều chỉnh hiệu quả và tính đặc hiệu của sự tái tổ hợp. Hai loại enzyme recombinase cũng tồn tại dưới dạng các thể đột biến khác nhau. Trong thực tế, trình tự LoxP hoặc FRT phải được thêm vào cấu trúc của gen.
Sự thay thế gen bằng thể đột biến sử dụng tái tổ hợp tương đồng kép
Ưu điểm chính của các hệ thống LoxP và FRT là sự tái tổ hợp chỉ xảy ra khi có mặt recombinase. Các tế bào hoặc động vật có vùng DNA tiếp giáp với các trình tự LoxP thì không có recombinase. Các enzyme này có thể được bổ sung vào trong tế bào in vitro hoặc in vivo ở động vật chuyển gen bằng cách vi tiêm trực tiếp vào tế bào chất hoặc bằng phương pháp chuyển nhiễm (transfection method) đối với protein. Gen recombinase có
thể được đưa vào tế bào bằng vector adenovirus. Các vector này được tiêm vào mô của động vật chuyển gen mang vùng DNA tiếp giáp với các trình tự LoxP. Hơn nữa, plasmid chứa các gen recombinase cũng có thể được đưa vào phôi giai đoạn một tế bào hoặc vào các tế bào soma. Các plasmid này có ít cơ hội hợp nhất do cấu trúc dạng vòng của chúng. Chúng biến mất nhanh chóng trong quá trình nhân tế bào và sự có mặt của recombinase là nhất thời.
Các recombinase cũng có thể được truyền cho động vật chuyển gen bằng sự chuyển gen. Chuột chuyển gen mang gen recombinase có thể được lai với các dòng chứa vùng DNA tiếp giáp với trình tự LoxP.
Một cách lý tưởng, các gen recombinase không nên biểu hiện ở nhiều trường hợp trong tất cả các mô hoặc biểu hiện thường xuyên. Nếu điều này là cần thiết thì recombinase có thể được đặt dưới sự kiểm soát của các promoter hoạt động trong tất cả các loại tế bào. Trái ngược lại, các promoter đặc hiệu đối với từng mô có thể hạn chế sự tái tổ hợp LoxP trong tế bào mà các promoter này hoạt động. Hệ thống biểu hiện này đã kiểm soát bởi tetrecycline và các dẫn xuất của tetracycline, cho phép gen recombinase chỉ được biểu hiện trong một loại tế bào và chỉ khi động vật có tetracycline.
Một bước điều hoà khác có thể thêm vào để kiểm soát recombinase Cre. Các gen dung hợp mang trình tự mã hoá recombinase Cre và một phần các thụ quan steroid đã được xây dựng. Protein dung hợp này chỉ hoạt động khi có mặt steroid và steroid đã gây ra sự biến đổi hình thể của protein.
Trình tự NLS (nuclear localization signal = tín hiệu định vị nhân) cho phép recombinase tập trung ở nhân và đạt hiệu quả ngay cả khi ở nồng độ thấp. Trường hợp này có thể xảy ra phụ thuộc vào tính đặc hiệu tế bào nhưng các promoter yếu đang được sử dụng để biểu hiện các gen recombinase.
Tất cả các hệ thống tinh vi này nhằm gây ra sự tái tổ hợp có thể càng chính xác để giống hệt như sự biểu hiện các gen tự nhiên hoặc để tạo ra các điều kiện thí nghiệm thích hợp nhất.
Điều quan trọng là tránh sự biểu hiện cao của gen ricombinase. Các enyzme này bộc lộ một vài độc tính đối với tế bào ở nồng độ cao, còn hầu như là thích hợp nhờ khả năng nhận biết các vị trí giống như LoxP hoặc FRT trong genome động vật.