- Dung dịch mẫu Placebo: cân khoảng 220 mg hỗn hợp Placebo trên Tiến hành xử lý như mẫu thử Lọc qua màng lọc 0,45μm.
3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT FLUNARIZIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VIÊN NANG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Tham khảo các tài liệu cho thấy: Flunarizin ở dạng muối HCl nên hoạt chất tan tốt trong dung dịch HCl loãng (0,1N). Tiến hành pha mẫu flunarizin chuẩn trong dung dịch HCl nồng độ 0,1N để được nồng độ 0,01 mg/ml. Tiến hành quét phổ UV-VIS từ 200 nm đến 400 nm trên máy quang phổ Shimadzu 1800. Kết quả Flunarizin hấp thụ tử ngoại ở bước sóng cực đại 253 nm, vì vậy chúng tôi chọn bước sóng 253 nm làm bước sóng detector để thu được tín hiệu cao nhất, đảm bảo độ nhạy của thiết bị, đối với Detector PDA dùng bước sóng 253 nm để lấy pic.
Qua tham khảo một số tài liệu [8], [14], [15], dựa trên độ phân cực, khả năng hòa tan của hoạt chất Flunarizin chúng tôi quyết định chọn cột C18; C8 để khảo sát các điều kiện sắc ký để phân tích mẫu, đây cũng là loại cột thông dụng và sẵn có trong phòng thí nghiệm.
Sau khi đã lựa chọn được pha tĩnh sử dụng sắc ký pha đảo, bước sóng để phát hiện cực đại 253 nm. Tiến hành pha mẫu chuẩn trong pha động với nồng độ mẫu 0,01 mg/ml. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1:
26
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký
Pha tĩnh (cột) Pha động (tốc độ pha động 1,0 ml/phút) tR (phút) Nhận xét C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM (70:30) 2,40
Pic xuất hiện sớm, nhọn, cân đối, độ lặp lại kém. C18; 250 x 4,6 mm; 5 µm AcCN : MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM (50:25:25) 12,66
Pic xuất hiện muộn, thời gian phân tích kéo dài. Độ cân đối của pic kém, pic bị kéo đuôi. C8; 150 x 4,6 mm; 5 µm AcCN : MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM (50:25:25) 9,82
Pic doãng, không cân đối. C8; 150 x 4,6 mm; 5 µm MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM pH=7,0 (60:40) 15,50
Pic doãng, không cân đối. C8; 150 x 4,6 mm; 5 µm MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM pH=4,0 (60:40) 6,89
Pic nhọn, cân đối.
C8;
150 x 4,6 mm; 5 µm
MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM
pH=3,5 (60:40) 3,17
Pic nhọn, cân đối. Hệ số dung lượng và yếu tố đuôi ở mức chấp nhận được.
27 Kết quả thực nghiệm nhận thấy:
+ Khi thêm thành phần Acetonitril vào pha động thời gian lưu của pic Flunarizin tăng lên. Acetonitril có độ phân cực lớn (dung môi trơ) trong khi Flunarizin khó tan hơn trong các dung môi phân cực nên tăng ái lực với pha tĩnh nên bị lưu giữ lâu hơn.
+ Khi thay đổi từ pha tĩnh C18 sang pha tĩnh C8 đã làm giảm ái lực của pha tĩnh với chất phân tích Flunarizin nên pic bị rửa giải sớm hơn. Các pic thu được từ sắc ký đồ khi phân tích trên pha tĩnh C8 nhọn và cân đối hơn so với khi phân tích trên pha tĩnh C18 với cùng pha động.
Từ những kết quả khảo sát trình bày ở trên chúng tôi xây dựng phương pháp định tính, định lượng Flunarizin bằng kỹ thuật HPLC như sau:
+ Cột: C8 (150 mm x 4,6; 5 µm; end-capped) hoặc cột tương đương. + Detector: UV-VIS 253 nm;
+ Pha động: MeOH : dung dịch KH2PO4 10 mM pH=3,5 (60:40) tt/tt + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Nồng độ mẫu phân tích: 0,01 mg/ml pha trong pha động. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl;
+ Nhiệt độ buồng cột: nhiệt độ phòng.