Xử lý
Cây mã đề tươi thu mua ở nơi có uy tín, đảm bảo chất lượng, độ tuổi thu hoạch,… được loại bỏ những phần hư hỏng, kém chất lượng. Sau đó tách riêng phần rễ, lá và hoa, chỉ lấy lá. Lá mã đề đem rửa sạch để loại tạp chất, đất cát rồi để ráo và đem đi phơi khô.
Phơi khô
Lá mã đề được phơi khô để làm giảm độ ẩm, giúp bảo quản được lâu hơn và thuận lợi cho quá trình trích ly. Lá mã đề được phơi nắng tự nhiên, khi phơi cần tản rời, phơi cho tới khi vò lá mã đề thấy vụn rời.
Xay
Lá mã đề khô được xay nhỏ để thuận lợi cho quá trinh chiết. Chiết
Quá trình chiết được thực hiện với phương pháp ngâm chiết bình thường trong bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt lên 700C, sử dụng dung môi ethanol với nồng 40%, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/30 g/ml. Chiết trong thời gian 1,5 giờ.
Lọc
Sau khi chiết xong, tiến hành đem lọc mẫu bằng giấy lọc để tách phần bã và thu được dịch chiết. Dịch chiết này có hoạt tính chống oxy hóa cao vì đã được lựa chọn nguyên liệu tốt và chiết trong điều kiện thích hợp. Dịch chiết thu được đem đuổi dung môi thu được sản phẩm cô đặc. Sản phẩm này có thể bảo quản lạnh, sử dụng cho các nghiên cứu ứng dụng về sau.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Kết quả nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề thu được cho phép kết luận.
1. Lá mã đề là bộ phận cây có khối lượng lớn nhất 73,22% còn tươi; 61,84% khi dã phơi khô. Lá cũng là bộ phận có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, tiếp đến là rễ và thấp nhất là hoa.
2. Điều kiện thích hợp để thu dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất từ lá mã đề khô (qui mô phòng thí nghiệm) bằng phương pháp ngâm chiết là:
- Nồng độ Ethanol: 40% - Nhiệt độ: 700C.
- Thời gian: 1,5 giờ.
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/30 (g/ml)
4.2. Kiến nghị
Mặc dù đã cố gắng trong quá trính làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu còn gặp nhiều khó khăn nên đề tài còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Do vậy em xin đề xuất một số ý kiến sau:
- Tiếp tục nghiên cứu quy trình đặc biệt trong công đoạn chiết (sử dụng phương pháp khác như siêu âm, Soxhlet,…và các loại dung môi khác).
- Nghiên cứu quy trình chiết chống oxy hóa từ các bộ phận khác như rễ, hạt,… của cây mã đề.
- Cần nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm mã đề vào trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1) Trần Thanh Hà (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học cây mã đề, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Cân Thơ.
2) Lê Thị Phương Lan, Lâm Ngọc Thọ, Nguyễn Ngọc Khôi (2010), Xây dựng qui trình định lượng polysaccharide trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang,
Tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 147-150.
3) Phan Thị Kim Ngân (2012), Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết từ tim sen, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang.
4) Hoàng Thị Thương (2011), Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế phản
ứng melanosis của dịch chiết nấm rơm, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang.
5) Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3700-79.
Tài liệu tiếng anh
6) Chiang L.C., Chiang W., Chang M.Y., Ng. L.T., Lin. C.C. (2002), Antiviral activity of Plantago major extracts and related compounds in vitro, Antiviral Research,55, 53–62.
7) Doan, D.D., Nguyen, N.H., Doan, H.K., Nguyen, T.L. (1992), Studies on the individual and combined diureticeffects of four Vietnamese traditional hermal remedies (Zea mays, Imperata cylindrica, Plantago major and Orthosiphon stamineus), Journal of Ethnopharmacology, 36, 225–231.
8) Harput U. Sebnem, Yasin Genc, Iclal Saracoglu, (2012), Cytotoxic and antioxidative activities of Plantago lagopus L. and characterization of its bioactive compounds, Food and Chemical Toxicology, 50,1554–1559.
9) Jamilah J., Sharifa A.A., Sharifah N.R.S.A (2012), GC-MS Analysis of Various Extracts from leaf of Plantago major Used as Traditional Medicine, World Applied Sciences Journal,17,67-70.
10)Mohamed, I.K., M.A. Osama, M.A.E. Samiha, E.M.M. Zahrat (2011), Biochemical studies on Plantago major L. and Cyamopsis tetragonoloba L,
11) Ravn H., Brimer, L. (1988), Structure and antibacterial activity of plantamajoside, a caffeic acid sugar ester from Plantago major subsp. Major,
Phytochemistry, 27, 3433–3437.
12) Ren Hong-Xu, Wang Zong-Ling, Xiong Chen, Zhu Yuan-Lin(1999), Antioxidative responses to different altitudes in Plantago major, Environmental and Experimental Botany, 42, 51-59.
13)Rice-Evans C.A., Miller, N.J Paganga, G. (1996), Structure antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Radical Biology and Medicine, 20, 933–956.
14)Samuelsen A.B,(2000),The traditional uses, chemical constituents and biological activitives of Plantago major L., A review, Journal of Ethnopharmacology, 71, 1-21.
Tài liệu internet.
15) http://www.baithuocquy.com/tag/cay-ma-de/99 16)https://diendancntpdhnt.wordpress.com/2012/04/06/c%C6%A1ch%E1%BA %BF-ho%E1%BA%A1t-d%E1%BB%99ng-ch%E1%BB%91ng-oxi-hoa/ 17)http://doc.edu.vn/tai-lieu/bao-cao-chat-chong-oxi-hoa-trong-thuc-pham- 9755/ 18)http://www.duoclieu.org/2012/07/chiet-xuat-phan-lap-cac-chat-tu-duoc- lieu.html 19)http://rcmp.org.vn/chi-tiet-bai-viet/197/cay-ma-de.html 20)http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/93 21)http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/bang-tra-cuu-muc-luc-cac- cong-trinh-nckh-ve-cay-ma-%C4%91e-plantago-major-l-co-tai-trung-tam- thong-tin-thu-vien-vien-duoc-lieu-648-50.html 22)http://yhocbandia.vn/hoat-dong-vien/nghien-cuu/dinh-danh-thuc-vat/cay-ma- de.html
PHỤ LỤC 1
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 1. Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng bộ phận cây mã đề.
1.2.1. Cách tiến hành
Cây mã đề tươi được thu mua một lần đảm bảo chất lượng làm sạch đất cát, tạp chất rồi để ráo. Lấy ngẫu nhiên 3 mẫu (gồm nhiều cây với khối lượng tương đương nhau). Mỗi mẫu tách riêng phần rễ, lá và hoa rồi đem cân từng bộ phận để xác định tỷ lệ khối lượng của chúng khi tươi. Sau đó đem phơi khô rồi tiếp tục cân từng bộ phận để xác định tỷ lệ khối lượng của chúng khi khô. Sử dụng cân phân tích có độ chính xác 10-4.
1.2.2. Tính kết quả
Tỷ lệ khối lượng của từng bộ phận cây mã đề được tính theo công thức: Xi(%) =𝐺𝑖
𝐺 × 100 Trong đó
Xi: Tỷ lệ khối lượng của từng bộ phận rễ, lá, hoa (%). Gi: Khối lượng của từng bộ phận cây (g)
G: Khối lượng của toàn bộ cây (g)
2. Phương pháp xác định độ ẩm.
a) Nguyên lý
Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô từ đó tính được hàm lượng nước trong thực phẩm (%).
b) Dụng cụ hóa chất
- Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ. - Cân phân tích độ chính xác 10-4g. - Đũa thủy tinh.
c) Tiến hành
Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 1000C ÷ 1050C trong khoảng 1 giờ sau đó lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi mang đi cân và sấy tiếp ở nhiệt độ trên, làm nguội trong bình hút ẩm và cân đến khi nào giữa hai lần cân lien tiếp sai khác khối lượng không quá 5.10-4g là được (sấy đến khối lượng không đổi).
Cân chính xác một lượng mã đề khô đã xay nhỏ (khoảng 2g) vào cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu rồi dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 600C ÷ 800C trong 2 giờ. Sau đó nâng nhiệt độ lên 1000C ÷ 1050C, sấy liên tục trong 3 giờ. Chú ý, trong quá trình sấy cứ sau 1 giờ đảo mẫu một lần.
Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích rồi sấy tiếp ở nhiệt độ 1000C ÷ 1050C đến khối lượng không đổi
d) Tính kết quả
Độ ẩm của tim sen được tính theo công thức: X (%) = G1−G2
𝐺1−𝐺 100
Trong đó:
X: Độ ẩm (hàm lượng nước) của tim sen (%).
G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g). G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g). G: Khối lượng cốc sấy (g).
3. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH.
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề được phân tích theo phương pháp Fu và cộng sự (2002).
a. Nguyên tắc
Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho gydrogen, làm giảm cường độ hấp phụ của dung dịch DPPH tại bước sóng hấp thụ cực đại 517nm, màu của dung dịch sẽ chuyển dần từ màu tím sang màu hồng nhạt.
b. Cách tiến hành
Mỗi mẫu cho vào 4 ống nghiệm với các thể tích ( 0,2ml, 0,3ml, 0,4ml, 0,5ml) dịch chiết mã đề đã được pha loãng bằng chính dung môi đã chiết. Thêm nước cất để mỗi ống đủ 2ml. Cho tiếp vào mỗi ống 1ml ethanol 99,5%. Cuối cùng cho vào mỗi ống 1ml DPPH 0,1mM pha trong ethanol 99,5%. Lắc đều bằng máy voltex rồi để phản ứng xảy ra trong bong tối 30 phút, lắc để trở lại rồi đem đo OD trên máy UV-VIS, bước sóng 517nm
Mỗi thí nghiệm được lặp 3 lần.
Mẫu đối chứng (mẫu trắng) được tiến hành tương tự nhưng không có dịch chiết mà thay vào đó là thêm nước cất cho đủ 2ml.
Xác định khả năng khử gốc tự do của DPPH của dịch chiết mã đề dựa vào đường chuẩn DPPH do Hoàng Thị Thương (2011) xây dựng trong “Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế phản ứng melanosis của dịch chiết nấm rơm”, (Đồ án tốt nghiệp, đại học Nha Trang). Lấy kết quả của thể tích dịch chiết 0,4 ml sau khi pha loãng để qui đổi về khả năng khử gốc tự do DPPH của 1ml dịch chiết ban đầu.
4. Phương pháp phân tích tổng năng lực khử
Tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề được phân tích theo phương pháp của Oyaizu (1986).
a. Nguyên tắc:
Các chất có khả năng chống oxi hóa có thể khử Fe3+ trong phân tử K3 [Fe(CN) 6] thành Fe2+ có khả năng tạo phức màu xanh dương với FeCl3. Đo sự thay đổi hấp phụ của phức tạo thành ở bước sóng 700nm có thể xác định được tổng năng lực khử của chất chống oxy hóa.
Các phương trình xảy ra như sau:
X + K3[Fe(CN) 6] K4[Fe(CN) 6] X + [Fe(CN) 6]3+ [Fe(CN) 6]4+ [Fe(CN) 6]4+ + Fe3+ Fe4[Fe(CN) 6]3
b. Cách tiến hành
Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống với các thể tích (0,2ml, 0,3ml, 0,4ml, 0,5ml) dịch chiết mã đề đã pha loãng trong chính dung môi chiết. Sau đó cho vào mỗi ống 0,5ml K3Fe(CN) 6 1%. Cho dung dịch đệm vào sao cho mỗi ống đủ 1,5ml, bọc giấy bạc lại. Hỗn hợp được lắc đều rồi đem ủ ở nhiệt độ 500C trong 20 phút.
Ủ xong, làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy. Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10%. Thêm 2 ml nước cất và 0,4 ml FeCl3 0,1%. Lắc đều. Mỗi thí nghiệm lặp 3 lần.
Tiến hành làm mẫu đối chứng nhưng không cho dịch chiết mà thay bằng dung dịch đệm.
Xác định tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề dựa vào độ hấp thụ màu của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm. Hỗn hợp phản ứng có độ hấp thụ càng cao thì tổng năng lực khử càng lớn. Lấy kết quả của thể tích dịch chiết 0,4 ml sau khi pha loãng để qui đổi về độ hấp thụ của 1ml dịch chiết ban đầu.
PHỤ LỤC 2
SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM
Bảng 1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phân cây mã đề. MÃ ĐỀ TƯƠI
Bộ phận cây
Khối lượng mã đề tươi (g) Tỷ lệ (%)
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 TB ĐLC Mẫu
1 Mẫu 2 Mẫu 3 TB ĐLC Rễ 563,7 599,2 58,45 58,25 1,78 14,63 15,96 14,89 15,16 0,7 Lá 283,76 266,81 294,37 281,65 13,9 73,62 71,06 74,99 73,22 1,99 Hoa 45,3 48,73 39,75 44,59 4,53 11,75 12,98 10,13 11,62 1,43 Tổng 385,43 375,46 392,57 384,49 8,59 100 100 100 100 MÃ ĐỀ KHÔ Bộ phận cây
Khối lượng mã đề khô (g) Tỷ lệ (%)
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 TBC ĐLC Mẫu
1 Mẫu 2 Mẫu 3 TB ĐLC Rễ 12,74 13,48 14,35 13,52 0,81 20,09 23,01 21,78 21,63 1,47 Lá 39,39 37,96 38,62 38,66 0,72 62,11 64,79 58,62 61,84 3,09 Hoa 11,29 7,18 12,95 10,47 2,97 17,8 12,25 19,66 16,57 3,86 Tổng 63,42 58,59 65,88 62,63 3,71 100 100 100 100
Bảng 2. Hàm ẩm của nguyên liệu lá mã đề khô.
Mẫu Khối lượng cốc
Khối lượng mẫu và
cốc
Khối lượng mẫu và
cốc sau khi sấy Độ ẩm (%) Lần1 Lần2 Lần1 Lần2 1 62,0778 62,0775 64,0893 63,7903 63,7898 14,8872 2 52,5937 52,0931 54,5571 54,2575 54,2573 12,1672 3 53,3117 53,3121 55,3232 55,0321 55,0324 14,4597 HÀM LƯỢNG TRUNG BÌNH 13,838 ĐỘ LỆCH CHUẨN 1,4627
Bảng 3. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề từ các bộ phận khác nhau. Pha loãng 70 lần.
Bộ phận cây
OD đo được ở bước sóng 517 nm Nồng độ DPPH còn lại (mM) Nồng độ DPPH bị khử (mM/ml) Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 TBC ĐLC Mẫu đối chứng 0,3562 0,3423 0,3719 0,1481 0,1424 0,1545 RỄ 0,1724 0,1565 0,189 0,0729 0,0664 0,0797 13,159 13,302 13,092 13,184 0,1072 LÁ 0,1179 0,1032 0,1368 0,0506 0,0446 0,0583 17,06 17,115 16,829 17,001 0,1519 HOA 0,2978 0,2849 0,3189 0,1242 0,1189 0,1328 4,1803 4,1087 3,7914 4,0268 0,207
Bảng 4. Tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề từ các bộ phận khác nhau. Pha loãng 60 lần.
Bộ phận cây
OD đo được ở bước sóng 700 nm OD ở 1ml dịch chiết ban đầu TBC ĐLC Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 RỄ 0,2574 0,2633 0,2571 38,615 39,495 38,565 38,89167 0,5231 LÁ 0,3167 0,3318 0,3332 47,5 49,765 49,98 49,08167 1,373975 HOA 0,1265 0,1318 0,1297 18,975 19,77 19,455 19,4 0,400344
Bảng 5. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề với nồng độ dung môi ethanol khác nhau. Pha loãng 70 lần.
Bảng 6. Tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề với nồng độ dung môi ethanol khác nhau. Pha loãng 60 lần. Nồng
độ ethanol
(%)
OD đo được ở bước sóng 700 nm OD ở 1ml dịch chiết ban đầu TBC ĐLC Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 30% 0,2583 0,2653 0,2525 38,745 39,8 37,88 38,8083 0,9616 40% 0,3068 0,3148 0,3371 46,02 47,22 50,56 47,9333 2,3526 50% 0,2943 0,3135 0,3329 44,14 47,025 49,935 47,0333 2,8975 60% 0,2768 0,2848 0,2954 41,52 42,72 44,305 42,8483 1,3969 70% 0,2329 0,2474 0,2374 34,93 37,105 35,605 35,88 1,1133 Nồng độ ethanol (%)
OD đo được ở bước sóng 517 nm Nồng độ DPPH còn lại (mM) Nồng độ DPPH bị khử (mM/ml) Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 TBC ĐLC Mẫu đối chứng 0,3621 0,3439 0,3477 0,1505 0,1431 0,1446 30% 0,2256 0,2044 0,2185 0,0946 0,086 0,0917 9,7684 9,9903 9,2458 9,6682 0,3822 40% 0,1975 0,1745 0,1807 0,0832 0,0738 0,0763 11,777 12,126 11,9539 11,9523 0,1742 50% 0,1965 0,1827 0,1845 0,0828 0,0771 0,0779 11,849 11,541 11,6772 11,6891 0,1542 60% 0,2142 0,1954 0,2042 0,09 0,0823 0,0859 10,582 10,63 10,2694 10,4937 0,1957 70% 0,2404 0,2262 0,2245 0,1007 0,0949 0,0942 8,709 8,4274 8,8139 8,6501 0,1999
Bảng 7. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề với nhiệt độ chiết khác nhau. Pha loãng 70 lần
Nhiệt độ (0C)
OD đo được ở bước sóng 517 nm Nồng độ DPPH còn lại (mM) Nồng độ DPPH bị khử (mM/ml) Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 TBC ĐLC Mẫu đối chứng 0,3439 0,3755 0,3661 0,1431 0,156 0,1521 Thường 0,2449 0,277 0,2719 0,1025 0,1157 0,1136 7,0912 7,0531 6,7381 6,9608 0,1938 40 0,1978 0,2328 0,2361 0,0873 0,0833 0,0989 10,4627 10,212 9,3031 9,9927 0,6102 50 0,1983 0,2314 0,2297 0,0835 0,097 0,0963 10,427 10,315 9,7588 10,167 0,3578 60 0,1949 0,2307 0,2271 0,0821 0,0967 0,0952 10,67 10,367 9,9497 10,329 0,3618 70 0,1735 0,2052 0,1954 0,0733 0,0863 0,0823 12,202 12,193 12,219 12,205 0,0133 80 0,1765 0,2045 0,1934 0,0746 0,086 0,0815 11,987 12,243 12,36 12,197 0,1904
Bảng 8. Tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề với nhiệt độ chiết khác nhau. Pha loãng 60 lần.
Nhiệt độ (0
C)
OD đo được ở bước sóng
700 nm OD ở 1ml dịch chiết ban đầu
TBC ĐLC Lần 1 Lần2 Lần3 Lần 1 Lần2 Lần3 Thường 0,1525 0,1559 0,1616 22,88 23,38 24,24 23,5 0,6879 40 0,1815 0,183 0,1873 27,22 27,455 28,1 27,5917 0,4556 50 0,1857 0,1817 0,1952 27,855 27,255 29,285 28,1317 1,0429 60 0,1823 0,1802 0,1928 27,34 27,035 28,92 27,765 1,0118 70 0,2194 0,2211 0,2323 32,915 33,16 34,84 33,6383 1,0479 80 0,2148 0,2224 0,2304 32,22 33,355 34,565 33,38 1,1727
Bảng 9. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề với thời gian chiết khác nhau. Pha loãng 70 lần