Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là:
-Sự hòa tan của chất tan vào dung môi.
-Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi.
-Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật.
Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất.
Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề về thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Dược liệu sau đó có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym. Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết.
Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa... tùy yêu cầu, điều kiện mà lực chọn kỹ thuật chiết thích hợp.
Các phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung mội được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn.
Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ
tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất.
Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất.
Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm
Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 KHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết.
Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng tng chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển. Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn. Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Do khả năng xuyên sâu kém nên việc sử dụng thường ở quy mô phòng thí nghiệm.
Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng
Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động đó là sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống.
Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa
tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn.
Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid...
Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn
Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn (super-critical fluid extraction,SFC) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính
cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên.
Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng.
Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tới hạn có khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả năng khuếch tán cao có thể dùng để hòa tan các chất và ứng dụng vào chiết xuất các chất trong dược liệu. Các đặc tính của chất lỏng quá tới hạn (khả năng hòa tan các chất, độ nhớt...) phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính (độ phân cực, khả năng hòa tan) của chất lỏng quá tới hạn. Trong thực tế, người ta thực hiện chiết trong điều kiện cao hơn điểm tới hạn một ít.
Chất lỏng thông dụng nhất hiện nay là CO2 lỏng quá tới hạn. Chiết chất lỏng quá tới hạn hiện nay được ứng dụng trong nhiều ngành ở quy mô công nghiệp (từ những năm 1978), trong nghiên cứu và phân tích kiểm nghiệm. Trong phạm vi nghiên cứu cây thuốc, tác giả đầu tiên ứng dụng nghiên cứu này là Stahl và cộng sự. Các nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng quá tới hạn là tinh dầu, chất béo, carotenoid và các chất kém phân cực khác.
Chiết dưới áp suất cao
Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết suất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction-PLE). Khả năng hòa than của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giả thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất.
Khi nhiệt độ tăng lên 100C, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi. Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-2000C và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là cây mã đề đang độ tuổi thu hoạch trong tháng 3/2015, đảm bảo chất lượng, được thu mua tại chợ Xóm Mới, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa.
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm công nghệ cao, phòng thí nghiệm hóa phân tích thuộc Trung tâm thí nghiệm thực hành, trường Đại Học Nha Trang.
Thời gian thực hiện: 15/3/2015 – 7/6/2015.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Dung môi ethanol sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết 99.5% ( Nhiệt độ sôi 78.9oC)
- Hóa chất Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCL3COOH 10%, FeCl3 0.1% sản xuất tại Guanghua Chemical Factory Co. Ltd.
- Các hóa chất trên được mua từ cửa hàng hóa chất Hoàng Trang số 42- Hoàng Hoa Thám- TP Nha Trang, đạt tiêu chuẩn dùng trong phòng thí nghiệm. - 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH) được mua từ công ty Sigma – Aldrich
INC, PO.Box 14508,st. Louis, MO63178 USA + 1-314-771-5750.
2.2.2. Dụng cụ
- Cốc sấy - Ống nghiệm
- Cốc thủy tinh 50 ml, 100ml, 250 ml - Bình tam giác 100ml, 250ml
- Phễu thủy tinh - Bóp cao su - Pipet 10 ml
- Ống đong 50ml, 100ml, 250 ml - Giấy lọc
2.2.3. Thiết bị
Tủ lạnh LG 595 lít, 5951,model GR-S592 QTC/BSIPCTT, Cân phân tích điện tử Shimadzu AY 120, Nhật.
Bể ổn nhiệt Memmert Model WB29, Đức. Cân phân tích AY220.
Cân kỹ thuật BL3200.
Máy đo quang phổ kế UV-Vis Carry 50. Tủ sấy vuông, Trung Quốc.
Micropipet 100-1000 μl, NPX-1000, Nhật Bản.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề từ các bộ phận cây.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thực nghiệm yếu tố từng phần cổ điển (thay đổi một yếu tố trong khi cố định các yếu tố còn lại).
2.4.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát
Hình 2.1. Sơ đồ bố thí thí nghiệm tổng quát
TÁCH RIÊNG RỄ, LÁ, HOA
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: Bộ phân cây, nồng
độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ NL/DM. XỬ LÝ CÂY MÃ ĐỀ TƯƠI PHƠI KHÔ XAY CHIẾT LỌC Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử. Kết luận DỊCH CHIẾT
Thuyết minh quy trình
Xử lý: Nguyên liệu tươi đảm bảo độ đồng đều, chất lượng tốt, được loại bỏ
các phần bị già úa, hư thối sau đó rửa sạch loại bỏ đất cát rồi tách riêng phần lá, hoa, rễ.
Phơi khô: Nguyên liệu tươi sẽ rất khó khăn trong việc bảo quản, vận chuyển
nguyên liệu tươi có hàm lượng nước cao, dưới tác dụng của enzyme và vi sinh vật nguyên liệu nhanh chóng bị hư hỏng và thất thoát các chất có hoạt tính. Do đó đem phơi khô làm giảm hàm ẩm đồng thời diệt enzyme giúp bảo quản được lâu hơn.
Xay: Nguyên liệu khô được xay nhỏ với mục đích làm tăng diện tích tiếp xúc
giữa dung môi và nguyên liệu, tăng khả năng khuếch tán và thẩm thấu của các chất vào dung môi, làm tăng khả năng trích ly. Sử dụng máy xay sinh tố, cối xay khô. Sau khi xay xong chia thành nhiều phần nhỏ đựng trong túi PE, tất cả các túi nhỏ đựng trong túi PA lớn. Nguyên liệu này được sử dụng cho hết quá trình nghiên cứu.
Chiết: Là công đoạn quan trọng sử dụng dung môi dựa trên sự thẩm thấu của
dung môi vào tế bào, các chất hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: Phương pháp, loại dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, số lần chiết.
Phương pháp chiết: Sử dụng phương pháp chiết tĩnh trong nghiên cứu này,
phương pháp chiết tĩnh đơn giản, không cần máy móc phức tạp, có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay.
Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ càng cao làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình,
tuy nhiên cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm mất hoạt tính của các chất cần trích ly.
Thời gian trích ly: Thời gian càng tăng thì hiệu suất trích ly càng tăng. Tuy
nhiên nếu thời gian quá dài thì khả năng trích ly lại giảm.
Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: Tỉ lệ này càng nhỏ thì hiệu suất trích ly của quá
trình càng cao. Tuy nhiên sử dụng nhiều dung môi sẽ làm giảm hiệu suất trích ly.
Loại dung môi: Sử dụng dung môi ethanol cho nghiên cứu này, dung môi
ethanol rẻ, dễ kiếm và ít độc hại, có hiệu quả cao trong việc tách chiết các chất chống oxi hóa trong các nghiên cứu trước đây.
Lọc: Mẫu sau khi chiết xong được lọc qua giấy lọc loại bỏ bã và thu được dịch
chiết. Dịch chiết sau đó được đem đi kiểm tra khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
2.4.2. Bố trí thí nghiệm.
2.4.2.1. Thí nghiệm 1: khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của của dịch chiết mã đề từ các bộ phận cây.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ các bộ phận cây mã đề. Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử. Kết luận Nồng độ dung môi: 40% Nhiệt độ: 500C Thời gian: 30 phút Tỷ lệ NL/DM: 1/20